Els metabòlits immunomoduladors són una característica clau del microambient tumoral (TME), però amb algunes excepcions, les seves identitats romanen en gran part desconegudes. Aquí, vam analitzar tumors i limfòcits T dels tumors i ascites de pacients amb carcinoma serós d'alt grau (HGSC) per revelar el metaboloma d'aquests diferents compartiments del TME. L'ascites i les cèl·lules tumorals tenen àmplies diferències en els metabòlits. En comparació amb l'ascites, els limfòcits T que s'infiltren en el tumor estan significativament enriquits en 1-metilnicotinamida (MNA). Tot i que el nivell de MNA en els limfòcits T és elevat, l'expressió de la nicotinamida N-metiltransferasa (un enzim que catalitza la transferència de grups metil de la S-adenosilmetionina a la nicotinamida) es limita als fibroblasts i les cèl·lules tumorals. Funcionalment, el MNA indueix els limfòcits T a secretar la citocina promotora de tumors, el factor de necrosi tumoral alfa. Per tant, el MNA derivat del TME contribueix a la regulació immunitària dels limfòcits T i representa una diana potencial d'immunoteràpia per al tractament del càncer humà.
Els metabòlits derivats de tumors poden tenir un profund efecte inhibidor sobre la immunitat antitumoral, i cada cop més evidències mostren que també poden servir com a força impulsora clau per a la progressió de la malaltia (1). A més de l'efecte Warburg, treballs recents han començat a caracteritzar l'estat metabòlic de les cèl·lules tumorals i la seva relació amb l'estat immunitari del microambient tumoral (TME). Estudis sobre models de ratolí i cèl·lules T humanes han demostrat que el metabolisme de la glutamina (2), el metabolisme oxidatiu (3) i el metabolisme de la glucosa (4) poden actuar independentment sobre diversos subgrups de cèl·lules immunitàries. Diversos metabòlits d'aquestes vies inhibeixen la funció antitumoral de les cèl·lules T. S'ha demostrat que el bloqueig del coenzim tetrahidrobiopterina (BH4) pot danyar la proliferació de cèl·lules T, i l'augment de BH4 al cos pot millorar la resposta immunitària antitumoral mediada per CD4 i CD8. A més, l'efecte immunosupressor de la quinurenina es pot rescatar mitjançant l'administració de BH4 (5). En el glioblastoma mutant de la isocitrat deshidrogenasa (IDH), la secreció de (R)-2-hidroxiglutarat (R-2-HG) enantiobòlic inhibeix l'activació, la proliferació i l'activitat de la citòlisi de les cèl·lules T (6). Recentment, s'ha demostrat que el metilglioxal, un subproducte de la glucòlisi, és produït per cèl·lules supressores d'origen mieloide, i la transferència de metilglioxal a les cèl·lules T pot inhibir la funció de les cèl·lules T efectores. En el tractament, la neutralització del metilglioxal pot superar l'activitat de les cèl·lules supressores derivades de mieloides (MDSC) i millorar sinèrgicament la teràpia de bloqueig de punts de control en models de ratolí (7). Aquests estudis emfatitzen col·lectivament el paper clau dels metabòlits derivats de TME en la regulació de la funció i l'activitat de les cèl·lules T.
La disfunció de les cèl·lules T s'ha descrit àmpliament en el càncer d'ovari (8). Això es deu en part a les característiques metabòliques inherents a la hipòxia i a la vasculatura tumoral anormal (9), que provoquen la conversió de glucosa i triptòfan en subproductes com l'àcid làctic i la quinurenina. L'excés de lactat extracel·lular redueix la producció d'interferó-γ (IFN-γ) i impulsa la diferenciació de subgrups mielosupressors (10, 11). El consum de triptòfan inhibeix directament la proliferació de cèl·lules T i inhibeix la senyalització del receptor de cèl·lules T (12-14). Malgrat aquestes observacions, es va dur a terme molta feina al voltant del metabolisme immunitari en cultius de cèl·lules T in vitro utilitzant medis optimitzats o limitats a models de ratolí homòlegs in vivo, cap dels quals reflecteix completament l'heterogeneïtat dels càncers humans i el macro i microentorn fisiològic.
Una característica comuna del càncer d'ovari és la propagació peritoneal i l'aparició d'ascites. L'acumulació de líquid cel·lular a l'ascites s'associa amb una malaltia avançada i un mal pronòstic (15). Segons els informes, aquest compartiment únic és hipòxic, té alts nivells de factor de creixement endotelial vascular (VEGF) i indoleamina 2,3-dioxigenasa (IDO), i està infiltrat per limfòcits T reguladors i cèl·lules inhibidores mieloides (15-18). L'entorn metabòlic de l'ascites pot ser diferent del del tumor en si, de manera que la reprogramació dels limfòcits T a l'espai peritoneal no està clara. A més, les diferències clau i l'heterogeneïtat entre l'ascites i els metabòlits presents a l'entorn tumoral poden dificultar la infiltració de cèl·lules immunitàries i la seva funció en els tumors, i cal més investigació.
Per tal de resoldre aquests problemes, vam dissenyar un mètode sensible de separació cel·lular i cromatografia líquida per espectrometria de masses en tàndem (LC-MS/MS) per estudiar diferents tipus de cèl·lules (incloses les cèl·lules T CD4+ i CD8+), així com dins i entre tumors. Els seus metabòlits abasten cèl·lules en el mateix entorn d'ascites i tumor del pacient. Utilitzem aquest mètode juntament amb citometria de flux d'alta dimensionalitat i seqüenciació d'ARN unicel·lular (scRNA-seq) per proporcionar un retrat altament resolt de l'estat metabòlic d'aquestes poblacions clau. Aquest mètode va revelar un augment significatiu del nivell d'1-metilnicotinamida (MNA) en les cèl·lules T tumorals, i els experiments in vitro van mostrar que l'efecte immunomodulador del MNA sobre la funció de les cèl·lules T era desconegut anteriorment. En general, aquest mètode revela les interaccions metabòliques mútues entre els tumors i les cèl·lules immunitàries, i proporciona informació única sobre els metabòlits de regulació immunitària, que poden ser útils per al tractament de la immunoteràpia del càncer d'ovari basada en cèl·lules T. Oportunitats de tractament.
Vam utilitzar citometria de flux d'alta dimensió per quantificar simultàniament l'absorció de glucosa [2-(N-(7-nitrofenil-2-oxa-1,3-diaza-4-il)amino)-2-desoxiglucosa (2-NBDG) i l'activitat mitocondrial [MitoTracker Deep Red (MT DR)] (7, 19, 20) són marcadors típics que distingeixen les cèl·lules immunitàries i les poblacions de cèl·lules tumorals (Taula S2 i Figura S1A). Aquesta anàlisi va mostrar que, en comparació amb els limfòcits T, les ascites i les cèl·lules tumorals tenen nivells d'absorció de glucosa més alts, però presenten diferències més petites en l'activitat mitocondrial. L'absorció mitjana de glucosa de les cèl·lules tumorals [CD45-EpCAM (EpCAM)+] és de tres a quatre vegades superior a la dels limfòcits T, i l'absorció mitjana de glucosa dels limfòcits T CD4+ és 1,2 vegades superior a la dels limfòcits T CD8+, cosa que indica que els limfòcits infiltrants del tumor (TIL) tenen requisits metabòlics diferents fins i tot en el mateix TME (Figura 1A). En canvi, l'activitat mitocondrial en les cèl·lules tumorals és similar a la de les cèl·lules T CD4+, i l'activitat mitocondrial d'ambdós tipus de cèl·lules és superior a la de les cèl·lules T CD8+ (Figura 1B). En general, aquests resultats revelen el nivell metabòlic. L'activitat metabòlica de les cèl·lules tumorals és superior a la de les cèl·lules T CD4+, i l'activitat metabòlica de les cèl·lules T CD4+ és superior a la de les cèl·lules T CD8+. Malgrat aquests efectes entre els tipus de cèl·lules, no hi ha una diferència consistent en l'estat metabòlic de les cèl·lules T CD4+ i CD8+ ni en les seves proporcions relatives en l'ascites en comparació amb els tumors (Figura 1C). En canvi, en la fracció de cèl·lules CD45, la proporció de cèl·lules EpCAM+ en el tumor va augmentar en comparació amb l'ascites (Figura 1D). També vam observar una clara diferència metabòlica entre els components de les cèl·lules EpCAM+ i EpCAM-. Les cèl·lules EpCAM+ (tumorals) tenen una captació de glucosa i una activitat mitocondrial més elevades que les cèl·lules EpCAM-, que és molt superior a l'activitat metabòlica dels fibroblasts en les cèl·lules tumorals en TME (Figura 1, E i F).
(A i B) Intensitat mitjana de fluorescència (MFI) de l'absorció de glucosa (2-NBDG) (A) i activitat mitocondrial de les cèl·lules T CD4+ (MitoTracker vermell fosc) (B) Gràfics representatius (esquerra) i dades tabulades (dreta), cèl·lules T CD8+ i cèl·lules tumorals EpCAM+ CD45 d'ascites i tumor. (C) La proporció de cèl·lules CD4+ i CD8+ (de cèl·lules T CD3+) en ascites i tumor. (D) Proporció de cèl·lules tumorals EpCAM+ en ascites i tumor (CD45−). (E i F) Absorció de glucosa EpCAM+ CD45-tumor i EpCAM-CD45-matriu (2-NBDG) (E) i activitat mitocondrial (MitoTracker vermell fosc) (F) Gràfics representatius (esquerra) i dades tabulades (dreta) Ascites i cèl·lules tumorals. (G) Gràfics representatius de l'expressió de CD25, CD137 i PD1 per citometria de flux. (H i I) Expressió de CD25, CD137 i PD1 en limfòcits T CD4+ (H) i limfòcits T CD8+ (I). (J i K) Fenotips naïf, de memòria central (Tcm), efector (Teff) i memòria efector (Tem) basats en l'expressió de CCR7 i CD45RO. Imatges representatives (esquerra) i dades tabulars (dreta) de limfòcits T CD4+ (J) i limfòcits T CD8+ (K) en ascites i tumors. Valors de P determinats per la prova t aparellada (*P<0,05, **P<0,01 i ***P<0,001). La línia representa els pacients aparellats (n = 6). FMO, fluorescència menys un; MFI, intensitat mitjana de fluorescència.
Una anàlisi més detallada va revelar altres diferències significatives entre l'estat fenotípic de les cèl·lules T altament resoltes. La memòria activada (Figura 1, G a I) i la memòria efectora (Figura 1, J i K) en els tumors són molt més freqüents que en l'ascites (proporció de cèl·lules T CD3+). De la mateixa manera, l'anàlisi del fenotip mitjançant l'expressió de marcadors d'activació (CD25 i CD137) i marcadors de depleció [proteïna de mort cel·lular programada 1 (PD1)] va mostrar que, tot i que les característiques metabòliques d'aquestes poblacions són diferents (Figura S1, B a E), no es van observar diferències metabòliques significatives de manera consistent entre subconjunts naïfs, efectors o de memòria (Figura S1, F a I). ​​Aquests resultats es van confirmar mitjançant mètodes d'aprenentatge automàtic per assignar fenotips cel·lulars automàticament (21), cosa que va revelar a més la presència d'un gran nombre de cèl·lules de medul·la òssia (CD45+/CD3-/CD4+/CD45RO+) en l'ascites del pacient (Figura S2A). Entre tots els tipus cel·lulars identificats, aquesta població de cèl·lules mieloides va mostrar la captació de glucosa i l'activitat mitocondrial més elevades (Figura S2, B a G). Aquests resultats destaquen les fortes diferències metabòliques entre els múltiples tipus de cèl·lules que es troben en ascites i tumors en pacients amb HGSC.
El principal repte per comprendre les característiques metabonòmiques del TIL és la necessitat d'aïllar mostres de cèl·lules T de puresa, qualitat i quantitat suficients dels tumors. Estudis recents han demostrat que els mètodes de classificació i enriquiment de perles basats en la citometria de flux poden conduir a canvis en els perfils dels metabòlits cel·lulars (22-24). Per superar aquest problema, vam optimitzar el mètode d'enriquiment de perles per aïllar i aïllar el TIL del càncer d'ovari humà resectat quirúrgicament abans de l'anàlisi mitjançant LC-MS/MS (vegeu Materials i mètodes; Figura 2A). Per tal d'avaluar l'impacte global d'aquest protocol en els canvis de metabòlits, vam comparar els perfils de metabòlits de cèl·lules T activades per donants sans després del pas de separació de perles anterior amb cèl·lules que no es van separar amb perles sinó que van romandre en gel. Aquesta anàlisi de control de qualitat va trobar que hi ha una alta correlació entre aquestes dues condicions (r = 0,77), i la repetibilitat tècnica del grup de 86 metabòlits té una alta repetibilitat (Figura 2B). Per tant, aquests mètodes poden realitzar anàlisis precises de metabòlits en cèl·lules sotmeses a enriquiment de tipus cel·lular, proporcionant així la primera plataforma d'alta resolució per identificar metabòlits específics en HGSC, permetent així a les persones obtenir una comprensió més profunda de l'especificitat cel·lular del programa de metabolisme sexual.
(A) Diagrama esquemàtic de l'enriquiment amb perles magnètiques. Abans de l'anàlisi mitjançant LC-MS/MS, les cèl·lules se sotmetran a tres rondes consecutives d'enriquiment amb perles magnètiques o romandran en gel. (B) L'efecte del tipus d'enriquiment sobre l'abundància de metabòlits. La mitjana de tres mesures per a cada tipus d'enriquiment ± SE. La línia grisa representa una relació 1:1. La correlació intraclasse (ICC) de mesures repetides que es mostra a l'etiqueta de l'eix. NAD, nicotinamida adenina dinucleòtid. (C) Diagrama esquemàtic del flux de treball de l'anàlisi de metabòlits del pacient. Les ascites o els tumors es recullen dels pacients i es criopreserven. Una petita porció de cada mostra es va analitzar mitjançant citometria de flux, mentre que les mostres restants es van sotmetre a tres rondes d'enriquiment per a cèl·lules CD4+, CD8+ i CD45-. Aquestes fraccions cel·lulars es van analitzar mitjançant LC-MS/MS. (D) Mapa de calor de l'abundància estandarditzada de metabòlits. El dendrograma representa l'agrupació de Ward de distàncies euclidianes entre mostres. (E) Anàlisi de components principals (PCA) del mapa de metabòlits de la mostra, que mostra tres rèpliques de cada mostra, les mostres del mateix pacient estan connectades per una línia. (F) L'ACP del perfil de metabòlits de la mostra condicionada al pacient (és a dir, utilitzant redundància parcial); el tipus de mostra està limitat per l'envolupant convexa. PC1, component principal 1; PC2, component principal 2.
A continuació, vam aplicar aquest mètode d'enriquiment per analitzar 99 metabòlits en les fraccions de cèl·lules CD4+, CD8+ i CD45- en l'ascites i els tumors primaris de sis pacients amb HGSC (Figura 2C, Figura S3A i Taula S3 i S4). La població d'interès representa entre el 2% i el 70% de la mostra gran original de cèl·lules vives, i la proporció de cèl·lules varia molt entre pacients. Després de separar les perles, la fracció enriquida d'interès (CD4+, CD8+ o CD45-) representa de mitjana més del 85% de totes les cèl·lules vives de la mostra. Aquest mètode d'enriquiment ens permet analitzar poblacions cel·lulars del metabolisme del teixit tumoral humà, cosa que és impossible de fer a partir de mostres grans. Mitjançant aquest protocol, vam determinar que la l-quinurenina i l'adenosina, aquests dos metabòlits immunosupressors ben caracteritzats, estaven elevats en cèl·lules T tumorals o cèl·lules tumorals (Figura S3, B i C). Per tant, aquests resultats demostren la fidelitat i la capacitat de la nostra tecnologia de separació cel·lular i espectrometria de masses per trobar metabòlits biològicament importants en els teixits dels pacients.
La nostra anàlisi també va revelar una forta separació metabòlica dels tipus cel·lulars dins i entre els pacients (Figura 2D i Figura S4A). En particular, en comparació amb altres pacients, el pacient 70 va mostrar característiques metabòliques diferents (Figura 2E i Figura S4B), cosa que indica que hi pot haver una heterogeneïtat metabòlica substancial entre els pacients. Cal destacar que, en comparació amb altres pacients (1,2 a 2 litres; Taula S1), la quantitat total d'ascites recollida en el pacient 70 (80 ml) va ser menor. El control de l'heterogeneïtat interpacient durant l'anàlisi de components principals (per exemple, mitjançant l'anàlisi de redundància parcial) mostra canvis consistents entre els tipus cel·lulars, i els tipus cel·lulars i/o el microambient estan clarament agregats segons el perfil del metabòlit (Figura 2F). L'anàlisi de metabòlits individuals va emfatitzar aquests efectes i va revelar diferències significatives entre els tipus cel·lulars i el microambient. Cal destacar que la diferència més extrema observada és l'MNA, que normalment està enriquit en cèl·lules CD45- i en cèl·lules CD4+ i CD8+ que s'infiltren al tumor (Figura 3A). Per a les cèl·lules CD4+, aquest efecte és més evident, i el MNA en les cèl·lules CD8+ també sembla estar fortament afectat per l'entorn. Tanmateix, això no és important, perquè només tres dels sis pacients poden ser avaluats per puntuacions de CD8+ tumorals. A més del MNA, en diferents tipus de cèl·lules en ascites i tumors, altres metabòlits que estan poc caracteritzats en TIL també són diferencialment rics (figures S3 i S4). Per tant, aquestes dades revelen un conjunt prometedor de metabòlits immunomoduladors per a futures investigacions.
(A) Contingut normalitzat de MNA en cèl·lules CD4+, CD8+ i CD45- d'ascites i tumors. El diagrama de caixa mostra la mediana (línia), el rang interquartílic (frontera del marc de referència) i el rang de dades, fins a 1,5 vegades el rang interquartílic (bigotis del marc de referència). Tal com es descriu a Materials i mètodes per al pacient, utilitzeu el valor limma del pacient per determinar el valor P (*P<0,05 i **P<0,01). (B) Diagrama esquemàtic del metabolisme de MNA (60). Metabòlits: S-adenosil-1-metionina; SAH, S-adenosina-1-homocisteïna; NA, nicotinamida; MNA, 1-metilnicotinamida; 2-PY, 1-metil-2-piridona-5-carboxamida; 4-PY, 1-metil-4-piridona-5-carboxamida; NR, nicotinamida ribosa; NMN, mononucleòtid de nicotinamida. Enzims (verd): NNMT, nicotinamida N-metiltransferasa; SIRT, sirtuïnes; NAMPT, nicotinamida fosforibosiltransferasa; AOX1, aldehid oxidasa 1; NRK, nicotinamida ribòsidcinasa; NMNAT, nicotinamida mononucleòtid adenilat transferasa; Pnp1, purina nucleòsid fosforilasa. (C) t-SNE de scRNA-seq d'ascites (gris) i tumor (vermell; n = 3 pacients). (D) Expressió de NNMT en diferents poblacions cel·lulars identificades mitjançant scRNA-seq. (E) Expressió de NNMT i AOX1 en SK-OV-3, ronyó embrionari humà (HEK) 293T, cèl·lules T i cèl·lules T tractades amb MNA. L'expressió plegada es mostra en relació amb SK-OV-3. Es mostra el patró d'expressió amb SEM (n = 6 donants sans). Els valors de Ct superiors a 35 es consideren indetectables (UD). (F) Expressió de SLC22A1 i SLC22A2 en limfòcits SK-OV-3, HEK293T, limfòcits T i limfòcits T tractats amb 8 mM de MNA. Es mostra l'expressió plegada en relació amb SK-OV-3. Es mostra el patró d'expressió amb SEM (n = 6 donants sans). Els valors de Ct superiors a 35 es consideren indetectables (UD). (G) Contingut de MNA cel·lular en limfòcits T de donants sans activats després de 72 hores d'incubació amb MNA. Es mostra el patró d'expressió amb SEM (n = 4 donants sans).
L'MNA es produeix transferint el grup metil de la S-adenosil-1-metionina (SAM) a la nicotinamida (NA) mitjançant la nicotinamida N-metiltransferasa (NNMT; Figura 3B). L'NNMT està sobreexpressat en una varietat de càncers humans i s'associa amb la proliferació, la invasió i la metàstasi (25-27). Per entendre millor la font de MNA en els limfòcits T en TME, vam utilitzar scRNA-seq per caracteritzar l'expressió de NNMT entre tipus de cèl·lules en l'ascites i els tumors de tres pacients amb HGSC (Taula S5). L'anàlisi d'aproximadament 6.500 cèl·lules va mostrar que en ascites i entorns tumorals, l'expressió de NNMT es restringia a les presumptes poblacions de fibroblasts i cèl·lules tumorals (Figura 3, C i D). Val la pena assenyalar que no hi ha cap expressió òbvia de NNMT en cap població que expressi PTPRC (CD45+) (Figura 3D i Figura S5A), la qual cosa indica que l'NNMT detectat a l'espectre del metabòlit s'ha introduït als limfòcits T. L'expressió de l'aldehid oxidasa 1 (AOX1) converteix l'MNA en 1-metil-2-piridona-5-carboxamida (2-PYR) o 1-metil-4-piridona-5-carboxamida (4-PYR); Figura 3B) també es limita a la població de fibroblasts que expressen COL1A1 (Figura S5A), que junts indiquen que els limfòcits T no tenen la capacitat del metabolisme convencional de l'MNA. El patró d'expressió d'aquests gens relacionats amb l'MNA es va verificar mitjançant un segon conjunt de dades cel·lulars independents d'ascites de pacients amb HGSC (Figura S5B; n = 6) (16). A més, l'anàlisi quantitativa de la reacció en cadena de la polimerasa (qPCR) de limfòcits T donants sans tractats amb MNA va mostrar que, en comparació amb les cèl·lules tumorals ovàriques SK-OV-3 de control, NNMT o AOX1 gairebé no s'expressaven (Figura 3E). Aquests resultats inesperats indiquen que l'MNA pot ser secretat per fibroblasts o tumors a limfòcits T adjacents en TME.
Tot i que els candidats inclouen la família de transportadors de cations orgànics 1 a 3 (OCT1, OCT2 i OCT3) codificats per la família del transportador soluble 22 (SLC22) (SLC22A1, SLC22A2 i SLC22A3), els possibles transportadors de MNA encara no estan definits (28). La QPCR de l'ARNm de cèl·lules T donants sanes va mostrar baixos nivells d'expressió de SLC22A1 però nivells indetectables de SLC22A2, cosa que va confirmar que s'havia descrit anteriorment a la literatura (Figura 3F) (29). En canvi, la línia cel·lular tumoral d'ovari SK-OV-3 va expressar alts nivells d'ambdós transportadors (Figura 3F).
Per tal de comprovar la possibilitat que els limfòcits T tinguin la capacitat d'absorbir MNA estrany, es van cultivar limfòcits T de donants sans durant 72 hores en presència de diferents concentracions de MNA. En absència de MNA exogen, no es pot detectar el contingut cel·lular de MNA (Figura 3G). Tanmateix, els limfòcits T activats tractats amb MNA exogen van mostrar un augment dependent de la dosi en el contingut de MNA a les cèl·lules, fins a 6 mM de MNA (Figura 3G). Aquest resultat indica que, malgrat el baix nivell d'expressió del transportador i la manca del principal enzim responsable del metabolisme intracel·lular del MNA, el TIL encara pot absorbir MNA.
L'espectre de metabòlits en els limfòcits T dels pacients i els experiments d'absorció de MNA in vitro augmenten la possibilitat que els fibroblasts associats al càncer (CAF) secretin MNA i que les cèl·lules tumorals puguin regular el fenotip i la funció del TIL. Per determinar l'efecte del MNA sobre els limfòcits T, es van activar in vitro limfòcits T donants sans en presència o absència de MNA, i es va avaluar la seva proliferació i producció de citocines. Després de 7 dies d'afegir MNA a la dosi més alta, el nombre de duplicació de la població es va reduir moderadament, mentre que el vigor es va mantenir a totes les dosis (Figura 4A). A més, el tractament amb MNA exogen va provocar un augment de la proporció de limfòcits T CD4+ i CD8+ que expressaven el factor de necrosi tumoral α (TNFα; Figura 4B). En canvi, la producció intracel·lular d'IFN-γ es va reduir significativament en els limfòcits T CD4+, però no en els limfòcits T CD8+, i no hi va haver cap canvi significatiu en la interleucina 2 (IL-2; Figura 4, C i D). Per tant, l'assaig immunosorbent lligat a enzims (ELISA) dels sobrenadants d'aquests cultius de cèl·lules T tractades amb MNA va mostrar un augment significatiu de TNFα, una disminució d'IFN-γ i cap canvi en IL-2 (Figura 4, E a G). La disminució d'IFN-γ indica que el MNA pot tenir un paper en la inhibició de l'activitat antitumoral dels limfòcits T. Per tal de simular l'efecte del MNA sobre la citotoxicitat mediada per limfòcits T, les cèl·lules mononuclears de sang perifèrica (PBMC) de donants sans produeixen cèl·lules T del receptor d'antigen quimèric (FRα-CAR-T) dirigides al receptor de folat α i a les cèl·lules CAR-T (GFP) regulades per la proteïna fluorescent verda (GFP) -CAR-T. Les cèl·lules CAR-T es van cultivar durant 24 hores en presència de MNA i després es van cocultivar amb cèl·lules tumorals ovàriques humanes SK-OV-3 que expressaven el receptor de folat α en una proporció efector-objectiu de 10:1. El tractament amb MNA va provocar una disminució significativa de l'activitat mortal de les cèl·lules FRα-CAR-T, similar a les cèl·lules FRα-CAR-T tractades amb adenosina (Figura 4H).
(A) Recompte total de cèl·lules viables i duplicació de la població (PD) directament del cultiu el dia 7. El gràfic de barres representa la mitjana + SEM de sis donants sans. Representa dades d'almenys n = 3 experiments independents. (B a D) Es van utilitzar CD3/CD28 i IL-2 per activar els limfòcits T a les seves respectives concentracions de MNA durant 7 dies. Abans de l'anàlisi, les cèl·lules es van estimular amb PMA/ionomicina amb GolgiStop durant 4 hores. Expressió de TNFα (B) en limfòcits T. Imatge d'exemple (esquerra) i dades tabulars (dreta) de l'expressió de TNFα en cèl·lules vives. Expressió d'IFN-γ (C) i IL-2 (D) en limfòcits T. L'expressió de citocines es va mesurar per citometria de flux. El gràfic de barres representa la mitjana (n = 6 donants sans) + SEM. Utilitzeu una anàlisi de la variància unidireccional i mesures repetides (*P<0,05 i **P<0,01) per determinar el valor P. Representa dades d'almenys n = 3 experiments independents. (E a G) Es van utilitzar CD3/CD28 i IL-2 per activar les cèl·lules T a les seves respectives concentracions de MNA durant 7 dies. El medi es va recollir abans i després de 4 hores d'estimulació amb PMA/ionomicina. Les concentracions de TNFα (E), IFN-γ (F) i IL-2 (G) es van mesurar mitjançant ELISA. El gràfic de barres representa la mitjana (n = 5 donants sans) + SEM. El valor P es va determinar mitjançant l'anàlisi de la variància unidireccional i mesures repetides (*P<0,05). La línia de punts indica el límit de detecció de la detecció. (H) Assaig de lisi cel·lular. Les cèl·lules FRα-CAR-T o GFP-CAR-T es van ajustar amb adenosina (250 μM) o MNA (10 mM) durant 24 hores, o es van deixar sense tractament (Ctrl). Es va mesurar el percentatge de destrucció de cèl·lules SK-OV-3. El valor P es va determinar mitjançant la prova t de Welch (*P<0,5 i **P<0,01).
Per tal d'obtenir una comprensió mecanística de la regulació de l'expressió del TNFα dependent de MNA, es van avaluar els canvis en l'ARNm del TNFα dels limfòcits T tractats amb MNA (Figura 5A). Els limfòcits T donants sans tractats amb MNA van mostrar un augment del doble en els nivells de transcripció del TNFα, cosa que indica que el MNA depèn de la regulació transcripcional del TNFα. Per investigar aquest possible mecanisme regulador, es van avaluar dos factors de transcripció coneguts que regulen el TNFα, concretament el factor nuclear de limfòcits T activats (NFAT) i la proteïna específica 1 (Sp1), en resposta a la unió del MNA al promotor proximal del TNFα (30). El promotor del TNFα conté 6 llocs d'unió de NFAT identificats i 2 llocs d'unió de Sp1, que se superposen en un lloc [-55 parells de bases (pb) des del cap 5'] (30). La immunoprecipitació de cromatina (ChIP) va mostrar que quan es tractava amb MNA, la unió de Sp1 al promotor del TNFα augmentava tres vegades. La incorporació de NFAT també augmentava i es va apropar a la importància (Figura 5B). Aquestes dades indiquen que l'MNA regula l'expressió de TNFα a través de la transcripció de Sp1, i en menor mesura l'expressió de NFAT.
(A) En comparació amb les cèl·lules T cultivades sense MNA, es mostra el canvi de plec de l'expressió de TNFα en cèl·lules T tractades amb MNA. Es mostra el patró d'expressió amb SEM (n = 5 donants sans). Representa dades d'almenys n = 3 experiments independents. (B) El promotor de TNFα de les cèl·lules T tractades amb o sense 8 mM de MNA després que NFAT i Sp1 es combinessin amb (Ctrl) i estimulació amb PMA/ionomicina durant 4 hores. La immunoglobulina G (IgG) i H3 es van utilitzar com a controls negatius i positius per a la immunoprecipitació, respectivament. La quantificació de ChIP va mostrar que la unió de Sp1 i NFAT al promotor de TNFα en les cèl·lules tractades amb MNA va augmentar diverses vegades en comparació amb el control. Representa dades d'almenys n = 3 experiments independents. Valor P determinat per múltiples proves t (*** P <0,01). (C) En comparació amb l'ascites de HGSC, les cèl·lules T (no citotòxiques) van mostrar una major expressió de TNF en el tumor. Els colors representen diferents pacients. Les cèl·lules mostrades s'han mostrejat aleatòriament fins a 300 i s'han canviat per limitar el sobreeiximent (** Padj = 0,0076). (D) Model proposat de MNA per al càncer d'ovari. El MNA es produeix en cèl·lules tumorals i fibroblasts en TME i és absorbit pels limfòcits T. El MNA augmenta la unió de Sp1 al promotor del TNFα, cosa que provoca un augment de la transcripció del TNFα i de la producció de citocines TNFα. El MNA també provoca una disminució de l'IFN-γ. La inhibició de la funció dels limfòcits T condueix a una reducció de la capacitat de letalitat i a un creixement tumoral accelerat.
Segons els informes, el TNFα té efectes antitumorals i antitumorals frontodependents, però té un paper ben conegut en la promoció del creixement i la metàstasi del càncer d'ovari (31-33). Segons els informes, la concentració de TNFα en ascites i teixits tumorals en pacients amb càncer d'ovari és més alta que en teixits benignes (34-36). Pel que fa al mecanisme, el TNFα pot regular l'activació, la funció i la proliferació dels glòbuls blancs i canviar el fenotip de les cèl·lules canceroses (37, 38). D'acord amb aquestes troballes, l'anàlisi diferencial de l'expressió gènica va mostrar que el TNF estava significativament regulat a l'alça en els limfòcits T en teixits tumorals en comparació amb l'ascites (Figura 5C). L'augment de l'expressió del TNF només va ser evident en poblacions de limfòcits T amb un fenotip no citotòxic (Figura S5A). En resum, aquestes dades donen suport a la idea que l'MNA té un doble efecte immunosupressor i promotor de tumors en el HGSC.
El marcatge fluorescent basat en citometria de flux s'ha convertit en el principal mètode per estudiar el metabolisme dels TIL. Aquests estudis han demostrat que, en comparació amb els limfòcits de la sang perifèrica o les cèl·lules T d'òrgans limfoides secundaris, els TIL murins i humans tenen una major tendència a l'absorció de glucosa (4, 39) i la pèrdua gradual de la funció mitocondrial (19, 40). Tot i que hem observat resultats similars en aquest estudi, el desenvolupament clau és comparar el metabolisme de les cèl·lules tumorals i els TIL del mateix teixit tumoral resectat. D'acord amb alguns d'aquests informes anteriors, les cèl·lules tumorals (CD45-EpCAM+) d'ascites i tumors tenen una absorció de glucosa més alta que les cèl·lules T CD8+ i CD4+, cosa que recolza que l'alta absorció de glucosa de les cèl·lules tumorals es pot comparar amb les cèl·lules T. El concepte de competència de cèl·lules T. TME. Tanmateix, l'activitat mitocondrial de les cèl·lules tumorals és superior a la de les cèl·lules T CD8+, però l'activitat mitocondrial és similar a la de les cèl·lules T CD4+. Aquests resultats reforcen el tema emergent que el metabolisme oxidatiu és important per a les cèl·lules tumorals (41, 42). També suggereixen que els limfòcits T CD8+ poden ser més susceptibles a la disfunció oxidativa que els limfòcits T CD4+, o que els limfòcits T CD4+ poden utilitzar fonts de carboni diferents de la glucosa per mantenir l'activitat mitocondrial (43, 44). Cal destacar que no vam observar cap diferència en l'absorció de glucosa o l'activitat mitocondrial entre els efectors T CD4+, la memòria de l'efector T i les cèl·lules T de memòria central en ascites. De la mateixa manera, l'estat de diferenciació dels limfòcits T CD8+ en els tumors no té res a veure amb els canvis en l'absorció de glucosa, cosa que destaca la diferència significativa entre els limfòcits T cultivats in vitro i els TIL humans in vivo (22). Aquestes observacions també es van confirmar mitjançant l'ús d'una assignació automàtica de població cel·lular imparcial, que va revelar a més que les cèl·lules CD45+ / CD3- / CD4+ / CD45RO+ amb una absorció de glucosa i activitat mitocondrial més elevades que les cèl·lules tumorals són prevalents però tenen una població de cèl·lules metabòlicament actives. Aquesta població pot representar la suposada subpoblació de cèl·lules supressores mieloides o cèl·lules dendrítiques plasmocitoides identificades a l'anàlisi scRNA-seq. Tot i que tots dos s'han descrit en tumors d'ovari humà [45], encara cal treballar més per descriure aquesta subpoblació mieloide.
Tot i que els mètodes basats en citometria de flux poden aclarir les diferències generals en el metabolisme de la glucosa i oxidatiu entre els tipus cel·lulars, encara no s'han determinat els metabòlits precisos produïts per la glucosa o altres fonts de carboni per al metabolisme mitocondrial en la TME. Assignar la presència o absència de metabòlits a un subconjunt TIL determinat requereix la purificació de la població cel·lular del teixit excisat. Per tant, el nostre mètode d'enriquiment cel·lular combinat amb espectrometria de masses pot proporcionar informació sobre els metabòlits que s'enriqueixen diferencialment en les poblacions de cèl·lules T i cèl·lules tumorals en mostres de pacients coincidents. Tot i que aquest mètode té avantatges respecte a la classificació cel·lular activada per fluorescència, certes biblioteques de metabòlits poden veure's afectades a causa de l'estabilitat inherent i/o la ràpida taxa de renovació (22). No obstant això, el nostre mètode va ser capaç d'identificar dos metabòlits immunosupressors reconeguts, l'adenosina i la quinurenina, perquè varien molt entre els tipus de mostra.
La nostra anàlisi metabonòmica de tumors i subtipus de TIL proporciona més informació sobre el paper dels metabòlits en l'EMT ovàric. En primer lloc, mitjançant citometria de flux, vam determinar que no hi havia cap diferència en l'activitat mitocondrial entre els tumors i els limfòcits T CD4+. Tanmateix, l'anàlisi LC-MS/MS va revelar canvis significatius en l'abundància de metabòlits entre aquestes poblacions, cosa que indica que les conclusions sobre el metabolisme del TIL i la seva activitat metabòlica general requereixen una interpretació acurada. En segon lloc, l'MNA és el metabòlit amb la major diferència entre les cèl·lules CD45 i els limfòcits T en ascites, no en tumors. Per tant, la compartimentació i la ubicació del tumor poden tenir efectes diferents sobre el metabolisme del TIL, cosa que destaca la possible heterogeneïtat en un microambient determinat. En tercer lloc, l'expressió de l'enzim productor de MNA NNMT es limita principalment a la CAF, que són cèl·lules tumorals en menor mesura, però s'observen nivells de MNA detectables en limfòcits T derivats de tumors. La sobreexpressió de NNMT en la CAF ovàrica té un efecte promotor del càncer conegut, en part a causa de la promoció del metabolisme de la CAF, la invasió tumoral i la metàstasi (27). Tot i que el nivell general de TIL és moderat, l'expressió de NNMT en CAF està estretament relacionada amb el subtipus mesenquimal de Cancer Genome Atlas (TCGA), que s'associa amb un mal pronòstic (27, 46, 47). Finalment, l'expressió de l'enzim AOX1 responsable de la degradació de MNA també es limita a la població CAF, cosa que indica que els limfòcits T no tenen la capacitat de metabolitzar MNA. Aquests resultats donen suport a la idea que, tot i que cal més treball per verificar aquesta troballa, els nivells alts de MNA en els limfòcits T poden indicar la presència d'un microambient CAF immunosupressor.
Donat el baix nivell d'expressió dels transportadors de MNA i els nivells indetectables de proteïnes clau implicades en el metabolisme de l'MNA, la presència de MNA en els limfòcits T és inesperada. Ni NNMT ni AOX1 es van poder detectar mitjançant l'anàlisi de scRNA-seq i la qPCR dirigida de dues cohorts independents. Aquests resultats indiquen que l'MNA no és sintetitzat pels limfòcits T, sinó que s'absorbeix del TME circumdant. Els experiments in vitro mostren que els limfòcits T tendeixen a acumular MNA exogen.
Els nostres estudis in vitro han demostrat que el MNA exogen indueix l'expressió de TNFα en cèl·lules T i millora la unió de Sp1 al promotor del TNFα. Tot i que el TNFα té funcions antitumorals i antitumorals, en el càncer d'ovari, el TNFα pot promoure el creixement del càncer d'ovari (31-33). La neutralització del TNFα en un cultiu de cèl·lules tumorals ovàriques o l'eliminació del senyal del TNFα en models de ratolí pot millorar la producció de citocines inflamatòries mediada per TNFα i inhibir el creixement tumoral (32, 35). Per tant, en aquest cas, el MNA derivat del TME pot actuar com a metabòlit proinflamatori a través d'un mecanisme dependent de TNFα a través del bucle autocrí, promovent així l'aparició i la propagació del càncer d'ovari (31). Basant-se en aquesta possibilitat, s'està estudiant el bloqueig del TNFα com a possible agent terapèutic per al càncer d'ovari (37, 48, 49). A més, el MNA deteriora la citotoxicitat de les cèl·lules CAR-T a les cèl·lules tumorals ovàriques, proporcionant més proves de la immunosupressió mediada per MNA. En conjunt, aquests resultats suggereixen un model en què els tumors i les cèl·lules CAF secreten MNA a l'ETM extracel·lular. A través de (i) l'estimulació del creixement del càncer d'ovari induïda per TNF i (ii) la inhibició de l'activitat citotòxica de les cèl·lules T induïda per MNA, això pot tenir un doble efecte tumoral (Figura 5D).
En conclusió, mitjançant l'aplicació d'una combinació d'enriquiment cel·lular ràpid, seqüenciació unicel·lular i perfilació metabòlica, aquest estudi va revelar les enormes diferències immunometabolòmiques entre tumors i cèl·lules d'ascites en pacients amb HGSC. Aquesta anàlisi exhaustiva va mostrar que hi ha diferències en l'absorció de glucosa i l'activitat mitocondrial entre els limfòcits T, i va identificar el MNA com un metabòlit regulador immunitari autònom no cel·lular. Aquestes dades tenen un impacte en com el TME afecta el metabolisme dels limfòcits T en els càncers humans. Tot i que s'ha informat de la competència directa pels nutrients entre els limfòcits T i les cèl·lules canceroses, els metabòlits també poden actuar com a reguladors indirectes per promoure la progressió tumoral i possiblement suprimir les respostes immunitàries endògenes. Una descripció més detallada del paper funcional d'aquests metabòlits reguladors pot obrir estratègies alternatives per millorar la resposta immunitària antitumoral.
Les mostres i les dades clíniques dels pacients es van obtenir a través del repositori de teixits tumorals de càncer de la Colúmbia Britànica certificat per la Canadian Tissue Repository Network. Segons el protocol aprovat pel BC Cancer Ethics Research Committee i la Universitat de la Colúmbia Britànica (H07-00463), totes les mostres i dades clíniques dels pacients van obtenir el consentiment informat per escrit o van renunciar formalment al seu consentiment. Les mostres s'emmagatzemen al BioBank certificat (BRC-00290). Les característiques detallades dels pacients es mostren a les taules S1 i S5. Per a la criopreservació, s'utilitza un bisturí per descompondre mecànicament la mostra tumoral del pacient i després passar-la a través d'un filtre de 100 micres per obtenir una suspensió cel·lular individual. L'ascites del pacient es va centrifugar a 1500 rpm durant 10 minuts a 4 °C per pelletar les cèl·lules i eliminar el sobrenedant. Les cèl·lules obtingudes de tumors i ascites es van criopreservar en sèrum AB humà inactivat per calor al 50% (Sigma-Aldrich), RPMI-1640 al 40% (Thermo Fisher Scientific) i dimetilsulfòxid al 10%. Aquestes suspensions de cèl·lules individuals preservades es van descongelar i es van utilitzar per a la metabolòmica i la determinació de metabòlits que es descriuen a continuació.
El medi complet consisteix en RPMI 1640: AimV filtrat a 0,22 μm i suplementat al 50:50. RPMI 1640 + 2,05 mM de l-glutamina (Thermo Fisher Scientific) suplementat amb un 10% de sèrum AB humà inactivat per calor (Sigma-Aldrich), 12,5 mM de Hepes (Thermo Fisher Scientific), 2 mM de l-glutamina (Thermo Fisher Scientific) (Fisher Scientific), 1 x solució de penicil·lina estreptomicina (PenStrep) (Thermo Fisher Scientific) i 50 μMB de mercaptoetanol. AimV (Invitrogen) es suplementa amb 20 mM de Hepes (Thermo Fisher Scientific) i 2 mM de l-glutamina (Thermo Fisher Scientific). El tampó de tinció del citòmetre de flux consistia en 0,22 μm de solució salina tamponada amb fosfat filtrada (PBS; Invitrogen) suplementada amb un 3% de sèrum AB humà inactivat per calor (Sigma). El tampó d'enriquiment cel·lular està compost de PBS filtrat de 0,22 μm i suplementat amb un 0,5% de sèrum AB humà inactivat per calor (Sigma-Aldrich).
En un medi complet a 37 °C, les cèl·lules es van tenyir amb 10 nM MT DR i 100 μM 2-NBDG durant 30 minuts. A continuació, les cèl·lules es van tenyir amb el colorant de viabilitat eF506 a 4 °C durant 15 minuts. Resuspendre les cèl·lules en FC Block (eBioscience) i Brilliant Stain Buffer (BD Biosciences), diluir en tampó de tinció de citòmetre de flux (segons les instruccions del fabricant) i incubar durant 10 minuts a temperatura ambient. Tenyir les cèl·lules amb un conjunt d'anticossos (Taula S2) en tampó de tinció de citometria de flux a 4 °C durant 20 minuts. Resuspendre les cèl·lules en tampó de tinció de citometria de flux (Cytek Aurora; configuració 3L-16V-14B-8R) abans de l'anàlisi. Utilitzar SpectroFlo i FlowJo V10 per analitzar les dades del recompte cel·lular i utilitzar GraphPad Prism 8 per crear les dades. La intensitat mediana de fluorescència (MFI) de 2-NBDG i MT DR es va normalitzar logarítmicament i, a continuació, es va utilitzar una prova t per a pacients emparellats per a l'anàlisi estadística per tenir en compte els pacients emparellats. Elimineu totes les poblacions amb menys de 40 esdeveniments de l'anàlisi; introduïu un valor MFI d'1 per a qualsevol valor negatiu abans de realitzar l'anàlisi estadística i la visualització de dades.
Per tal de complementar l'estratègia de comporta manual del panell de procés anterior, vam utilitzar l'anotació completa de l'arbre de restricció de forma (FAUST) (21) per assignar automàticament les cèl·lules a la població després d'eliminar les cèl·lules mortes a FlowJo. Gestionem manualment la sortida per fusionar les poblacions que semblen estar mal assignades (combinant cèl·lules PD1+ amb cèl·lules tumorals PD1) i les poblacions retingudes. Cada mostra conté una mitjana de més del 2% de cèl·lules, per a un total d'11 poblacions.
Es va utilitzar centrifugació de densitat de gradient de Ficoll per separar les PBMC dels productes de separació de leucòcits (STEMCELL Technologies). Les cèl·lules T CD8+ es van aïllar de les PBMC utilitzant CD8 MicroBeads (Miltenyi) i es van expandir en medi complet utilitzant TransAct (Miltenyi) durant 2 setmanes segons les instruccions del fabricant. Es va deixar reposar les cèl·lules durant 5 dies en un medi complet que contenia IL-7 (10 ng/ml; PeproTech) i després es van reestimular amb TransAct. El dia 7, segons les instruccions del fabricant, es van utilitzar CD45 MicroBeads humanes (Miltenyi) per enriquir les cèl·lules en tres rondes consecutives. Les cèl·lules es van aliquotar per a l'anàlisi de citometria de flux (tal com s'ha descrit anteriorment) i es va aliquotar un milió de cèl·lules tres vegades per a l'anàlisi LC-MS/MS. Les mostres es van processar mitjançant LC-MS/MS tal com es descriu a continuació. Vam estimar el valor del metabòlit que faltava amb un nombre d'ions de 1.000. Cada mostra es normalitza pel nombre total d'ions (TIC), es converteix logarítmicament i es normalitza automàticament a MetaboAnalystR abans de l'anàlisi.
La suspensió de cèl·lules individuals de cada pacient es va descongelar i es va filtrar a través d'un filtre de 40 μm fins a obtenir un medi complet (com s'ha descrit anteriorment). Segons el protocol del fabricant, es van utilitzar tres rondes consecutives de selecció positiva mitjançant separació amb microesferes magnètiques utilitzant MicroBeads (Miltenyi) per enriquir les mostres per a cèl·lules CD8+, CD4+ i CD45- (sobre gel). En resum, les cèl·lules es resuspenen en tampó d'enriquiment cel·lular (com s'ha descrit anteriorment) i es compten. Les cèl·lules es van incubar amb esferes CD8 humanes, esferes CD4 humanes o esferes CD45 humanes (Miltenyi) a 4 °C durant 15 minuts i després es van rentar amb tampó d'enriquiment cel·lular. La mostra es passa a través de la columna LS (Miltenyi) i es recullen les fraccions positives i negatives. Per tal de reduir la durada i maximitzar el pas de recuperació cel·lular, la fracció CD8 s'utilitza per a la segona ronda d'enriquiment amb CD4+ i la fracció CD4 s'utilitza per al posterior enriquiment amb CD45. Mantingueu la solució sobre gel durant tot el procés de separació.
Per preparar mostres per a l'anàlisi de metabòlits, les cèl·lules es van rentar una vegada amb una solució salina gelada i es va afegir 1 ml de metanol al 80% a cada mostra, després es van vortexar i es van congelar ràpidament en nitrogen líquid. Les mostres es van sotmetre a tres cicles de congelació-descongelació i es van centrifugar a 14.000 rpm durant 15 minuts a 4 °C. El sobrenedant que conté els metabòlits s'evapora fins que s'asseca. Els metabòlits es van tornar a dissoldre en 50 μl d'àcid fòrmic al 0,03%, es van vortexar per barrejar-los i després es van centrifugar per eliminar les restes.
Extraieu els metabòlits tal com s'ha descrit anteriorment. Transferiu el sobrenedant a una ampolla de cromatografia líquida d'alt rendiment per a la investigació metabolòmica. Utilitzeu un protocol de tractament aleatori per tractar cada mostra amb un nombre similar de cèl·lules per evitar efectes per lots. Vam realitzar una avaluació qualitativa dels metabòlits globals publicada anteriorment a l'espectròmetre de masses de triple quadrupol AB SCIEX QTRAP 5500 (50). L'anàlisi cromatogràfica i la integració de l'àrea del pic es van realitzar mitjançant el programari MultiQuant versió 2.1 (Applied Biosystems SCIEX).
Es va utilitzar un recompte d'ions de 1000 per estimar el valor del metabòlit que faltava, i el TIC de cada mostra es va utilitzar per calcular l'àrea del pic normalitzada de cada metabòlit detectat per corregir els canvis introduïts per l'anàlisi instrumental del processament de mostres. Després de normalitzar el TIC, s'utilitza MetaboAnalystR(51) (paràmetre per defecte) per a la conversió logarítmica i l'escalat automàtic de la línia de norma. Vam utilitzar PCA amb el paquet R vegà per realitzar una anàlisi exploratòria de les diferències de metabolomes entre els tipus de mostra i vam utilitzar una anàlisi de redundància parcial per analitzar els pacients. Vam utilitzar el mètode Ward per construir un dendrograma de mapa de calor per agrupar la distància euclidiana entre mostres. Vam utilitzar limma (52) en l'abundància de metabòlits estandarditzada per identificar metabòlits diferencialment abundants a tot el tipus cel·lular i el microambient. Per simplificar l'explicació, utilitzem el paràmetre de la mitjana del grup per especificar el model i considerem els tipus cel·lulars del microambient com a cada grup (n = 6 grups); per a la prova de significació, vam realitzar tres mesures repetides per a cada metabòlit. Per evitar una falsa replicació, el pacient es va incloure com a obstacle en el disseny de limma. Per tal de comprovar les diferències en els metabòlits entre diferents pacients, vam ajustar el model limma incloent-hi els pacients de manera fixa. Informem de la significació del contrast preespecificat entre el tipus cel·lular i el microambient de Padj <0,05 (correcció de Benjamini-Hochberg).
Després de l'enriquiment de vigor utilitzant el kit d'eliminació de cèl·lules mortes de Miltenyi (viabilitat >80%), es va realitzar la seqüenciació del transcriptoma unicel·lular en el total de mostres d'ascites i tumors congelades vives utilitzant un protocol d'expressió gènica 10x 5′. Es van analitzar cinc casos amb tumors i ascites coincidents, tot i que la baixa viabilitat d'una mostra de tumor va impedir la seva inclusió. Per tal d'aconseguir múltiples seleccions de pacients, vam combinar les mostres de cada pacient als carrils del controlador de crom 10x i vam analitzar les ascites i els llocs tumorals per separat. Després de la seqüenciació [Illumina HiSeq 4000 28×98 bp paired end (PE), genoma de Quebec; una mitjana de 73.488 i 41.378 lectures per cèl·lula per a tumor i ascites respectivament]], vam utilitzar CellSNP i Vireo (53) (basats en CellSNP com a [SNP]. El SNP humà comú (VCF) proporcionat per GRCh38 té assignada una identitat de donant. Utilitzem SNPRelate per inferir la identitat més propera (IBS) de l'estat del genotip del pacient (IBS), excloent les cèl·lules no assignades i les cèl·lules identificades com a dúplex i donants coincidents entre mostres d'ascites i tumors (54). A partir d'aquesta tasca, vam retenir tres casos amb representació cel·lular abundant al tumor i ascites per a l'anàlisi posterior. Després de realitzar un pas de filtració massiva en l'encapsulament BioConductor scater (55) i scran (56), això va produir 6975 cèl·lules (2792 i 4183 cèl·lules de tumor i ascites, respectivament) per a l'anàlisi. Utilitzem l'agrupació de Louvain (57) de la xarxa de veïns més propers compartida (SNN) basada en la distància de Jaccard a les cèl·lules del clúster per expressió. Els clústers es van anotar manualment als possibles tipus de cèl·lules basant-se en l'expressió del gen marcador i es van visualitzar amb t-SNE. Els limfòcits T citotòxics es defineixen per l'expressió de CD8A i GZMA, excloent els subclústers amb baixa expressió de proteïnes ribosòmiques. Vam accedir a les dades publicades d'Izar et al. (16), inclosa la seva incrustació de t-SNE, que pot controlar la superposició d'expressió entre els marcadors de cèl·lules immunitàries i l'expressió de NNMT.
Les PBMC es van separar dels productes de separació de leucòcits (STEMCELL Technologies) mitjançant centrifugació de densitat en gradient de Ficoll. Les cèl·lules CD3+ es van aïllar de les PBMC utilitzant perles CD3 (Miltenyi). En presència o absència de MNA, les cèl·lules CD3+ es van activar amb CD3 unit a la placa (5 μg/ml), CD28 soluble (3 μg/ml) i IL-2 (300 U/ml; Proleukin). L'últim dia d'expansió, es va avaluar la viabilitat (Fixable Viability Dye eFluor450, eBioscience) i la proliferació (123count eBeads, Thermo Fisher Scientific) mitjançant citometria de flux. Avaluar la funció efectora estimulant les cèl·lules amb PMA (20 ng/ml) i ionomicina (1 μg/ml) amb GolgiStop durant 4 hores i monitoritzar CD8-PerCP (RPA-T8, BioLegend), CD4-AF700 (RPA-T4), BioLegend) i isotiocianat de TNFα-fluoresceïna (FITC) (MAb11, BD). Estimular les cèl·lules qPCR i ChIP amb PMA (20 ng/ml) i ionomicina (1 μg/ml) durant 4 hores. El sobrenedant d'ELISA es va recollir abans i després de l'estimulació amb PMA (20 ng/ml) i ionomicina (1 μg/ml) durant 4 hores.
Seguiu el protocol del fabricant per aïllar l'ARN utilitzant el kit RNeasy Plus Mini (QIAGEN). Utilitzeu QIAshredder (QIAGEN) per homogeneïtzar la mostra. Utilitzeu el kit d'ARN a ADNc d'alta capacitat (Thermo Fisher Scientific) per sintetitzar ADN complementari (ADNc). Utilitzeu TaqMan Rapid Advanced Master Mix (Thermo Fisher Scientific) per quantificar l'expressió gènica (segons el protocol del fabricant) amb les sondes següents: Hs00196287_m1 (NNMT), Hs00154079_m1 (AOX1), Hs00427552_m1 (SLC22A1), Hs02786624_g1 [gliceraldehid-3-fosfat d'hidrogen (GAPDH)] i Hs01010726_m1 (SLC22A2). Les mostres es van executar al sistema de PCR en temps real StepOnePlus (Applied Biosystems) (Applied Biosystems) a la placa de reacció òptica ràpida MicroAmp de 96 pous (Applied Biosystems) amb pel·lícula òptica MicroAmp. Qualsevol valor de Ct que superi 35 es considera per sobre del llindar de detecció i es marca com a indetectable.
Realitzeu el ChIP tal com s'ha descrit anteriorment (58). En resum, les cèl·lules es van tractar amb formaldehid (concentració final 1,42%) i es van incubar a temperatura ambient durant 10 minuts. Utilitzeu un tampó d'inflamació suplementat (25 mM Hepes, 1,5 mM MgCl2, 10 mM KCl i 0,1% NP-40) sobre gel durant 10 minuts i després resuspendre en tampó d'immunoprecipitació tal com s'ha descrit (58). A continuació, la mostra es va sonicar amb els cicles següents: 10 cicles (20 polsos d'1 segon) i un temps estàtic de 40 segons. Incubeu la immunoglobulina G de grau ChIP (Cell Signaling Technology; 1 μl), la histona H3 (Cell Signaling Technology; 3 μl), l'NFAT (Invitrogen; 3 μl) i els anticossos SP1 (Cell Signaling Technology; 3 μl) amb la mostra a 4 °CC i agiteu-la durant la nit. Incubeu les perles de proteïna A (Thermo Fisher Scientific) amb la mostra a 4 °C amb agitació suau durant 1 hora, després utilitzeu perles Chelex (Bio-Rad) per enriquir l'ADN i utilitzeu proteinasa K (Thermo Fisher) per a la digestió de les proteïnes. El promotor del TNFα es va detectar per PCR: directe, GGG TAT CCT TGA TGC TTG TGT; al contrari, GTG CCA ACA ACT GCC TTT ATA TG (producte de 207 pb). Les imatges van ser produïdes per Image Lab (Bio-Rad) i quantificades mitjançant el programari ImageJ.
El sobrenedant del cultiu cel·lular es va recollir tal com s'ha descrit anteriorment. La determinació es va dur a terme segons els procediments del fabricant del kit ELISA de TNFα humà (Invitrogen), el kit ELISA d'IL-2 humà (Invitrogen) i el kit ELISA d'IFN-γ humà (Abcam). Segons el protocol del fabricant, el sobrenedant es va diluir 1:100 per detectar TNFα i IL-2, i 1:3 per detectar IFN-γ. Utilitzeu el lector multilabel EnVision 2104 (PerkinElmer) per mesurar l'absorbància a 450 nm.
Les PBMC es van separar dels productes de separació de leucòcits (STEMCELL Technologies) mitjançant centrifugació de densitat de gradient de Ficoll. Les cèl·lules CD3+ es van aïllar de les PBMC utilitzant perles CD3 (Miltenyi). En presència o absència de MNA, les cèl·lules CD3+ es van activar amb CD3 unit a la placa (5 μg/ml), CD28 soluble (3 μg/ml) i IL-2 (300 U/ml; Proleukin) durant 3 dies. Després de 3 dies, es van recollir les cèl·lules i es van rentar amb solució salina al 0,9%, i el pellet es va congelar ràpidament. El recompte cel·lular es va realitzar per citometria de flux (Cytek Aurora; configuració 3L-16V-14B-8R) utilitzant eBeads de 123 recomptes.
Extraieu els metabòlits tal com s'ha descrit anteriorment. L'extracte sec es va reconstituir a una concentració de 4000 equivalents cel·lulars/μl. Analitzeu la mostra mitjançant cromatografia de fase inversa (1290 Infinity II, Agilent Technologies, Santa Clara, CA) i columna CORTECS T3 (2,1 × 150 mm, mida de partícula 1,6 μm, mida de porus 120 Å; #186008500, Waters). Espectròmetre de masses polar (6470, Agilent), en què la ionització per electroaspersió funciona en mode positiu. La fase mòbil A és 0,1% d'àcid fòrmic (en H2O), la fase mòbil B és 90% d'acetonitril, 0,1% d'àcid fòrmic. El gradient de LC és de 0 a 2 minuts per al 100% A, de 2 a 7,1 minuts per al 99% B i de 7,1 a 8 minuts per al 99% B. A continuació, reequilibreu la columna amb la fase mòbil A a un cabal de 0,6 ml/min durant 3 minuts. El cabal és de 0,4 ml/min i la cambra de la columna s'escalfa a 50 °C. Utilitzeu l'estàndard químic pur de MNA (M320995, Toronto Research Chemical Company, North York, Ontario, Canadà) per establir el temps de retenció (RT) i la transformació (RT = 0,882 minuts, transformació 1 = 137→94,1, transformació 2 = 137→92, conversió 3 = 137→78). Quan les tres transicions es produeixen al temps de retenció correcte, la transició 1 s'utilitza per a la quantificació per garantir l'especificitat. La corba estàndard de MNA (Toronto Research Chemical Company) es va generar mitjançant sis dilucions en sèrie de la solució stock (1 mg/ml) per obtenir estàndards de 0,1, 1,0, 10 i 100 ng/ml i 1,0 i 10 μg/ml respectivament de líquid. El límit de detecció és d'1 ng/ml, i la resposta lineal es troba entre 10 ng/ml i 10 μg/ml. Cada injecció de dos microlitres de mostra i estàndard s'utilitza per a l'anàlisi LC/MS, i s'executa una mostra de control de qualitat mixta cada vuit injeccions per garantir l'estabilitat de la plataforma d'anàlisi. Les respostes de MNA de totes les mostres cel·lulars tractades amb MNA estaven dins del rang lineal de l'assaig. L'anàlisi de dades es va dur a terme mitjançant el programari d'anàlisi quantitativa MassHunter (v9.0, Agilent).
La construcció αFR-CAR de segona generació es va extreure de Song et al. (59). En resum, la construcció conté el següent contingut: seqüència líder CD8a, fragment variable de cadena única específic d'αFR humà, regió transmembrana i frontissa CD8a, domini intracel·lular CD27 i domini intracel·lular CD3z. La seqüència CAR completa es va sintetitzar mitjançant GenScript i després es va clonar al vector d'expressió lentiviral de segona generació aigües amunt del casset d'expressió GFP utilitzat per avaluar l'eficiència de la transducció.
El lentivirus es produeix per transfecció de cèl·lules HEK293T [American Type Culture Collection (ATCC); cultivades en medi Eagle modificat per Dulbecco que conté un 10% de sèrum fetal boví (FBS) i un 1% de PenStrep, i s'utilitza el vector CAR-GFP. Els plasmidis d'empaquetament (psPAX2 i pMD2.G, Addgene) utilitzen amina de lipofecció (Sigma-Aldrich). El sobrenedant que contenia el virus es va recollir 48 i 72 hores després de la transfecció, es va filtrar i es va concentrar per ultracentrifugació. Emmagatzemar el sobrenedant viral concentrat a -80 °C fins a la transducció.
Les PBMC es separen dels productes de separació de leucòcits de donants sans (STEMCELL Technologies) mitjançant centrifugació de densitat en gradient de Ficoll. Utilitzeu microperles CD8 de selecció positiva (Miltenyi) per aïllar les cèl·lules CD8+ de les PBMC. Estimular les cèl·lules T amb TransAct (Miltenyi) i en medi TexMACS [Miltenyi; suplementat amb un 3% de sèrum humà inactivat per calor, un 1% de PenStrep i IL-2 (300 U/ml)]. Vint-i-quatre hores després de l'estimulació, les cèl·lules T es van transduir amb lentivirus (10 μl de sobrenedant de virus concentrat per 106 cèl·lules). D'1 a 3 dies després de la transducció en Cytek Aurora (en FSC (Forward Scatter)/SSC (Side Scatter), Singlet, GFP+), avaluar l'expressió de GFP de les cèl·lules per demostrar una eficiència de transducció d'almenys el 30%.
Les cèl·lules CAR-T es van cultivar durant 24 hores en Immunocult (STEMCELL Technologies; suplementat amb 1% de PenStrep) en les condicions següents: sense tractament, tractades amb 250 μM d'adenosina o 10 mM de MNA. Després del pretractament, les cèl·lules CAR-T es van rentar amb PBS i es van combinar amb 20.000 cèl·lules SK-OV-3 [ATCC; en medi McCoy 5A (Sigma-Aldrich) suplementat amb 10% de FBS i 1% de PenStrep a 10: La relació efector-objectiu d'1 es va amplificar per triplicat en medi Immunocult suplementat. Les cèl·lules SK-OV-3 i les cèl·lules SK-OV-3 lisades amb saponina digital (0,5 mg/ml; Sigma-Aldrich) es van utilitzar com a controls negatius i positius, respectivament. Després de 24 hores de cocultiu, es va recollir el sobrenedant i es va mesurar la lactat deshidrogenasa (LDH) segons les instruccions del fabricant (kit d'assaig de citotoxicitat LDH Glo, Promega). El sobrenedant de LDH es va diluir 1:50 en tampó LDH. El percentatge de destrucció es va mesurar mitjançant la fórmula següent: percentatge de destrucció = percentatge de correcció / taxa màxima de destrucció x 100%, on percentatge de correcció = cocultiu només amb cèl·lules T i taxa màxima de destrucció = control positiu - control negatiu.
Tal com es descriu al text o als materials i mètodes, utilitzeu GraphPad Prism 8, Microsoft Excel o R v3.6.0 per a l'anàlisi estadística. Si es recullen diverses mostres del mateix pacient (com ara ascites i tumors), utilitzem una prova t aparellada o incloem el pacient com a efecte aleatori en un model lineal o generalitzat, segons correspongui. Per a l'anàlisi metabolòmica, la prova d'importància es realitza per triplicat.
Per a materials suplementaris per a aquest article, consulteu http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/4/eabe1174/DC1
Aquest és un article d'accés obert distribuït sota els termes de la Llicència Creative Commons Reconeixement-NoComercial, que permet l'ús, la distribució i la reproducció en qualsevol mitjà, sempre que l'ús final no sigui amb finalitats comercials i la premissa sigui que l'obra original sigui correcta. Referència.
Nota: Només us demanem que proporcioneu la vostra adreça electrònica perquè la persona que recomaneu a la pàgina sàpiga que voleu que vegi el correu electrònic i que no és correu brossa. No capturarem cap adreça electrònica.
Aquesta pregunta s'utilitza per comprovar si sou un visitant i evitar l'enviament automàtic de correu brossa.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H. Nelson), Ralph J. De Russel Jones (Brad H. Nelson), Ralph J. De Russel De Russel Jones (Ralph De Bellardini) G. Jones), Phineas T. Hamilton (Phineas T.
L'MNA contribueix a la immunosupressió dels limfòcits T i representa una possible diana d'immunoteràpia per al tractament del càncer humà.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H. Nelson), Ralph J. De Russel Jones (Brad H. Nelson), Ralph J. De Russel De Russel Jones (Ralph De Bellardini) G. Jones), Phineas T. Hamilton (Phineas T.
L'MNA contribueix a la immunosupressió dels limfòcits T i representa una possible diana d'immunoteràpia per al tractament del càncer humà.
©2021 Associació Americana per a l'Avenç de la Ciència. tots els drets reservats. AAAS és soci de HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef i COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.