L'àcid propiònic (PPA), un agent antifúngic i additiu dietètic comú, ha demostrat causar un neurodesenvolupament anormal en ratolins acompanyat de disfunció gastrointestinal, que pot ser causada per disbiosi intestinal. S'ha suggerit una relació entre l'exposició dietètica al PPA i la disbiosi de la microbiota intestinal, però no s'ha investigat directament. Aquí, vam investigar els canvis associats al PPA en la composició de la microbiota intestinal que poden conduir a la disbiosi. Els microbiomes intestinals de ratolins alimentats amb una dieta no tractada (n = 9) i una dieta enriquida amb PPA (n = 13) es van seqüenciar mitjançant la seqüenciació metagenòmica de llarg abast per avaluar les diferències en la composició microbiana i les vies metabòliques bacterianes. El PPA dietètic es va associar amb un augment de l'abundància de tàxons significatius, incloent diverses espècies de Bacteroides, Prevotella i Ruminococcus, membres de les quals han estat implicats anteriorment en la producció de PPA. Els microbiomes dels ratolins exposats al PPA també tenien més vies relacionades amb el metabolisme dels lípids i la biosíntesi d'hormones esteroides. Els nostres resultats indiquen que el PPA pot alterar la microbiota intestinal i les seves vies metabòliques associades. Aquests canvis observats destaquen que els conservants classificats com a segurs per al consum poden influir en la composició de la microbiota intestinal i, al seu torn, en la salut humana. Entre ells, es selecciona P, G o S segons el nivell de classificació que s'analitza. Per minimitzar l'impacte de les classificacions falsos positius, es va adoptar un llindar mínim d'abundància relativa d'1e-4 (1/10.000 lectures). Abans de l'anàlisi estadística, les abundàncies relatives reportades per Bracken (fraction_total_reads) es van transformar mitjançant la transformació del raó logarítmica centrada (CLR) (Aitchison, 1982). Es va escollir el mètode CLR per a la transformació de dades perquè és invariant a l'escala i suficient per a conjunts de dades no dispersos (Gloor et al., 2017). La transformació CLR utilitza el logaritme natural. Les dades de recompte reportades per Bracken es van normalitzar mitjançant l'expressió logarítmica relativa (RLE) (Anders i Huber, 2010). Les xifres es van generar mitjançant una combinació de matplotlib v. 3.7.1, seaborn v. 3.7.2 i logaritmes seqüencials (Gloor et al., 2017). 0.12.2 i stantanotations v. 0.5.0 (Hunter, 2007; Waskom, 2021; Charlier et al., 2022). La proporció Bacillus/Bacteroidetes es va calcular per a cada mostra utilitzant recomptes bacterians normalitzats. Els valors reportats a les taules s'arrodonien a 4 decimals. L'índex de diversitat de Simpson es va calcular mitjançant l'script alpha_diversity.py proporcionat al paquet KrakenTools v. 1.2 (Lu et al., 2022). L'informe de Bracken es proporciona a l'script i l'índex de Simpson "Si" es proporciona per al paràmetre -an. Les diferències significatives en l'abundància es van definir com a diferències mitjanes de CLR ≥ 1 o ≤ -1. Una diferència mitjana de CLR de ±1 indica un augment de 2,7 vegades en l'abundància d'un tipus de mostra. El signe (+/-) indica si el taxó és més abundant a la mostra PPA i a la mostra de control, respectivament. La significació es va determinar mitjançant la prova U de Mann-Whitney (Virtanen et al., 2020). Es va utilitzar Statsmodels v. 0.14 (Benjamini i Hochberg, 1995; Seabold i Perktold, 2010) i es va aplicar el procediment de Benjamini-Hochberg per corregir les proves múltiples. Es va utilitzar un valor p ajustat ≤ 0,05 com a llindar per determinar la significació estadística.
El microbioma humà sovint es coneix com "l'últim òrgan del cos" i juga un paper vital en la salut humana (Baquero i Nombela, 2012). En particular, el microbioma intestinal és reconegut per la seva influència en tot el sistema i el seu paper en moltes funcions essencials. Els bacteris comensals són abundants a l'intestí, ocupen múltiples nínxols ecològics, utilitzen nutrients i competeixen amb possibles patògens (Jandhyala et al., 2015). Diversos components bacterians de la microbiota intestinal són capaços de produir nutrients essencials com ara vitamines i promoure la digestió (Rowland et al., 2018). També s'ha demostrat que els metabòlits bacterians influeixen en el desenvolupament dels teixits i milloren les vies metabòliques i immunitàries (Heijtz et al., 2011; Yu et al., 2022). La composició del microbioma intestinal humà és extremadament diversa i depèn de factors genètics i ambientals com la dieta, el sexe, els medicaments i l'estat de salut (Kumbhare et al., 2019).
La dieta materna és un component crític del desenvolupament fetal i neonatal i una possible font de compostos que poden influir en el desenvolupament (Bazer et al., 2004; Innis, 2014). Un d'aquests compostos d'interès és l'àcid propiònic (PPA), un subproducte d'àcid gras de cadena curta obtingut de la fermentació bacteriana i un additiu alimentari (den Besten et al., 2013). El PPA té propietats antibacterianes i antifúngiques i, per tant, s'utilitza com a conservant alimentari i en aplicacions industrials per inhibir el creixement de floridura i bacteris (Wemmenhove et al., 2016). El PPA té efectes diferents en diferents teixits. Al fetge, el PPA té efectes antiinflamatoris en afectar l'expressió de citocines en macròfags (Kawasoe et al., 2022). Aquest efecte regulador també s'ha observat en altres cèl·lules immunitàries, cosa que condueix a una regulació a la baixa de la inflamació (Haase et al., 2021). Tanmateix, s'ha observat l'efecte contrari al cervell. Estudis previs han demostrat que l'exposició al PPA indueix un comportament semblant a l'autisme en ratolins (El-Ansary et al., 2012). Altres estudis han demostrat que el PPA pot induir gliosi i activar vies proinflamatòries al cervell (Abdelli et al., 2019). Com que el PPA és un àcid feble, es pot difondre a través de l'epiteli intestinal al torrent sanguini i, per tant, creuar barreres restrictives, inclosa la barrera hematoencefàlica i la placenta (Stinson et al., 2019), cosa que destaca la importància del PPA com a metabòlit regulador produït pels bacteris. Tot i que el paper potencial del PPA com a factor de risc per a l'autisme està actualment sota investigació, els seus efectes en individus amb autisme poden anar més enllà de la inducció de la diferenciació neuronal.
Els símptomes gastrointestinals com la diarrea i el restrenyiment són freqüents en pacients amb trastorns del neurodesenvolupament (Cao et al., 2021). Estudis previs han demostrat que el microbioma dels pacients amb trastorns de l'espectre autista (TEA) difereix del dels individus sans, cosa que suggereix la presència de disbiosi de la microbiota intestinal (Finegold et al., 2010). De la mateixa manera, les característiques del microbioma dels pacients amb malalties inflamatòries intestinals, obesitat, malaltia d'Alzheimer, etc. també difereixen de les dels individus sans (Turnbaugh et al., 2009; Vogt et al., 2017; Henke et al., 2019). No obstant això, fins ara, no s'ha establert cap relació causal entre el microbioma intestinal i les malalties o símptomes neurològics (Yap et al., 2021), tot i que es creu que diverses espècies bacterianes tenen un paper en alguns d'aquests estats de malaltia. Per exemple, Akkermansia, Bacteroides, Clostridium, Lactobacillus, Desulfovibrio i altres gèneres són més abundants en la microbiota de pacients amb autisme (Tomova et al., 2015; Golubeva et al., 2017; Cristiano et al., 2018; Zurita et al., 2020). Cal destacar que se sap que les espècies membres d'alguns d'aquests gèneres posseeixen gens associats amb la producció de PPA (Reichardt et al., 2014; Yun i Lee, 2016; Zhang et al., 2019; Baur i Dürre, 2023). Ateses les propietats antimicrobianes del PPA, augmentar-ne l'abundància pot ser beneficiós per al creixement de bacteris productors de PPA (Jacobson et al., 2018). Per tant, un entorn ric en PFA pot provocar canvis en la microbiota intestinal, inclosos patògens gastrointestinals, que poden ser factors potencials que condueixen a símptomes gastrointestinals.
Una qüestió central en la investigació del microbioma és si les diferències en la composició microbiana són una causa o un símptoma de malalties subjacents. El primer pas per elucidar la complexa relació entre la dieta, el microbioma intestinal i les malalties neurològiques és avaluar els efectes de la dieta sobre la composició microbiana. Amb aquesta finalitat, vam utilitzar la seqüenciació metagenòmica de lectura llarga per comparar els microbiomes intestinals de descendència de ratolins alimentats amb una dieta rica en PPA o amb poca PPA. La descendència va ser alimentada amb la mateixa dieta que les seves mares. Vam plantejar la hipòtesi que una dieta rica en PPA provocaria canvis en la composició microbiana intestinal i en les vies funcionals microbianes, en particular les relacionades amb el metabolisme del PPA i/o la producció de PPA.
Aquest estudi va utilitzar ratolins transgènics FVB/N-Tg(GFAP-GFP)14Mes/J (Jackson Laboratories) que sobreexpressen la proteïna fluorescent verda (GFP) sota el control del promotor GFAP específic de la glia, seguint les directrius del Comitè Institucional de Cura i Ús d'Animals de la Universitat de Florida Central (UCF-IACUC) (Número de permís d'ús d'animals: PROTO202000002). Després del deslletament, els ratolins es van allotjar individualment en gàbies amb 1-5 ratolins de cada sexe per gàbia. Els ratolins es van alimentar ad libitum amb una dieta de control purificada (dieta estàndard oberta modificada, 16 kcal% de greix) o una dieta suplementada amb propionat de sodi (dieta estàndard oberta modificada, 16 kcal% de greix, que conté 5.000 ppm de propionat de sodi). La quantitat de propionat de sodi utilitzada va ser equivalent a 5.000 mg de PFA/kg de pes total dels aliments. Aquesta és la concentració més alta de PPA aprovada per al seu ús com a conservant alimentari. Per preparar-se per a aquest estudi, els ratolins progenitors van rebre les dues dietes durant 4 setmanes abans de l'aparellament i van continuar durant tot l'embaràs de la mare. Els ratolins descendents [22 ratolins, 9 controls (6 mascles, 3 femelles) i 13 PPA (4 mascles, 9 femelles)] van ser deslletats i després van continuar amb la mateixa dieta que les mares durant 5 mesos. Els ratolins descendents van ser sacrificats als 5 mesos d'edat i el seu contingut fecal intestinal es va recollir i es va emmagatzemar inicialment en tubs de microcentrífuga d'1,5 ml a -20 °C i després es van transferir a un congelador a -80 °C fins que es va esgotar l'ADN de l'hoste i es van extreure els àcids nucleics microbians.
L'ADN de l'hoste es va eliminar segons un protocol modificat (Charalampous et al., 2019). Breument, el contingut fecal es va transferir a 500 µl d'InhibitEX (Qiagen, Cat#/ID: 19593) i es va emmagatzemar congelat. Processar un màxim d'1-2 pellets fecals per extracció. A continuació, es va homogeneïtzar mecànicament el contingut fecal amb una mà de plàstic dins del tub per formar una suspensió. Centrifugar les mostres a 10.000 RCF durant 5 minuts o fins que les mostres s'hagin pelletat, després aspirar el sobrenedant i resuspendre el pellet en 250 µl de 1× PBS. Afegir 250 µl de solució de saponina al 4,4% (TCI, número de producte S0019) a la mostra com a detergent per afluixar les membranes de les cèl·lules eucariotes. Les mostres es van barrejar suaument fins que quedessin suaus i es van incubar a temperatura ambient durant 10 minuts. A continuació, per dissoldre les cèl·lules eucariotes, es van afegir 350 μl d'aigua lliure de nucleases a la mostra, es va incubar durant 30 s i després es van afegir 12 μl de NaCl 5 M. Les mostres es van centrifugar a 6000 RCF durant 5 min. Aspireu el sobrenedant i resuspendre el precipitat en 100 μl de PBS 1X. Per eliminar l'ADN hoste, afegiu 100 μl de tampó HL-SAN (12,8568 g de NaCl, 4 ml de MgCl2 1M, 36 ml d'aigua lliure de nucleases) i 10 μl d'enzim HL-SAN (ArticZymes P/N 70910-202). Les mostres es van barrejar completament pipetejant i es van incubar a 37 °C durant 30 min a 800 rpm en un Eppendorf™ ThermoMixer C. Després de la incubació, es van centrifugar a 6000 RCF durant 3 min i es van rentar dues vegades amb 800 µl i 1000 µl de PBS 1X. Finalment, es va resuspendre el precipitat en 100 µl de PBS 1X.
L'ADN bacterià total es va aïllar utilitzant el kit de purificació d'ADN genòmic Monarch de New England Biolabs (New England Biolabs, Ipswich, MA, núm. de cat. T3010L). El procediment operatiu estàndard proporcionat amb el kit es modifica lleugerament. Incubeu i manteniu aigua lliure de nucleases a 60 °C abans de l'operació per a l'elució final. Afegiu 10 µl de proteinasa K i 3 µl de RNasa A a cada mostra. A continuació, afegiu 100 µl de tampó de lisi cel·lular i barregeu suaument. A continuació, les mostres es van incubar en un Eppendorf™ ThermoMixer C a 56 °C i 1400 rpm durant almenys 1 hora i fins a 3 hores. Les mostres incubades es van centrifugar a 12.000 RCF durant 3 minuts i el sobrenedant de cada mostra es va transferir a un tub de microcentrífuga d'1,5 mL separat que contenia 400 µL de solució d'unió. A continuació, els tubs es van vortexar per polsos durant 5-10 segons a intervals d'1 segon. Transferiu tot el contingut líquid de cada mostra (aproximadament 600–700 µL) a un cartutx de filtre col·locat en un tub de recollida de flux continu. Els tubs es van centrifugar a 1.000 RCF durant 3 minuts per permetre la unió inicial de l'ADN i després es van centrifugar a 12.000 RCF durant 1 minut per eliminar el líquid residual. La columna de mostra es va transferir a un nou tub de recollida i després es va rentar dues vegades. Per al primer rentat, afegiu 500 µL de tampó de rentat a cada tub. Invertiu el tub de 3 a 5 vegades i després centrifugueu a 12.000 RCF durant 1 minut. Descarteu el líquid del tub de recollida i torneu a col·locar el cartutx de filtre al mateix tub de recollida. Per al segon rentat, afegiu 500 µL de tampó de rentat al filtre sense invertir-lo. Les mostres es van centrifugar a 12.000 RCF durant 1 minut. Transferiu el filtre a un tub LoBind® d'1,5 mL i afegiu-hi 100 µL d'aigua lliure de nucleases preescalfada. Els filtres es van incubar a temperatura ambient durant 1 minut i després es van centrifugar a 12.000 RCF durant 1 minut. L'ADN eluït es va emmagatzemar a -80 °C.
La concentració d'ADN es va quantificar mitjançant un fluoròmetre Qubit™ 4.0. L'ADN es va preparar mitjançant el kit d'alta sensibilitat Qubit™ 1X dsDNA (núm. de cat. Q33231) segons les instruccions del fabricant. La distribució de la longitud dels fragments d'ADN es va mesurar mitjançant una TapeStation Aglient™ 4150 o 4200. L'ADN es va preparar mitjançant els reactius d'ADN genòmic Agilent™ (núm. de cat. 5067-5366) i la cinta Genomic DNA ScreenTape (núm. de cat. 5067-5365). La preparació de la biblioteca es va dur a terme mitjançant el kit de codificació de barres Oxford Nanopore Technologies™ (ONT) Rapid PCR (SQK-RPB004) segons les instruccions del fabricant. L'ADN es va seqüenciar mitjançant un seqüenciador ONT GridION™ Mk1 amb una cel·la de flux Min106D (R 9.4.1). Els paràmetres de seqüenciació van ser: crida de base d'alta precisió, valor q mínim de 9, configuració del codi de barres i retall del codi de barres. Les mostres es van seqüenciar durant 72 hores, després de les quals es van enviar les dades de la crida base per al seu posterior processament i anàlisi.
El processament bioinformàtic es va dur a terme mitjançant mètodes descrits anteriorment (Greenman et al., 2024). Els fitxers FASTQ obtinguts de la seqüenciació es van dividir en directoris per a cada mostra. Abans de l'anàlisi bioinformàtica, les dades es van processar mitjançant el següent pipeline: primer, els fitxers FASTQ de les mostres es van fusionar en un únic fitxer FASTQ. A continuació, les lectures inferiors a 1000 bp es van filtrar mitjançant Filtlong v. 0.2.1, amb l'únic paràmetre canviat sent –min_length 1000 (Wick, 2024). Abans de més filtratges, la qualitat de lectura es va controlar mitjançant NanoPlot v. 1.41.3 amb els paràmetres següents: –fastq –plots dot –N50 -o
Per a la classificació taxonòmica, les lectures i els contigs assemblats es van classificar mitjançant Kraken2 v. 2.1.2 (Wood et al., 2019). Genereu informes i fitxers de sortida per a lectures i assemblatges, respectivament. Utilitzeu l'opció –use-names per analitzar lectures i assemblatges. Les opcions –gzip-compressed i –paired s'especifiquen per als segments de lectura. L'abundància relativa de tàxons en metagenomes es va estimar mitjançant Bracken v. 2.8 (Lu et al., 2017). Primer vam crear una base de dades kmer que conté 1000 bases mitjançant bracken-build amb els paràmetres següents: -d
L'anotació gènica i l'estimació de l'abundància relativa es van dur a terme mitjançant una versió modificada del protocol descrit per Maranga et al. (Maranga et al., 2023). Primer, els contigs de menys de 500 pb es van eliminar de tots els assemblatges mitjançant SeqKit v. 2.5.1 (Shen et al., 2016). Els assemblatges seleccionats es van combinar en un pan-metagenoma. Els marcs de lectura oberts (ORF) es van identificar mitjançant Prodigal v. 1.0.1 (una versió paral·lela de Prodigal v. 2.6.3) amb els paràmetres següents: -d
Els gens es van agrupar primer segons els identificadors ortòlegs (KO) de la Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) assignats per eggNOG per comparar les abundàncies de les vies gèniques. Els gens sense knockouts o els gens amb múltiples knockouts es van eliminar abans de l'anàlisi. A continuació, es va calcular l'abundància mitjana de cada KO per mostra i es va realitzar una anàlisi estadística. Els gens del metabolisme del PPA es van definir com qualsevol gen al qual se li havia assignat una fila ko00640 a la columna KEGG_Pathway, cosa que indica un paper en el metabolisme del propionat segons KEGG. Els gens identificats com a associats amb la producció de PPA es mostren a la Taula Suplementària 1 (Reichardt et al., 2014; Yang et al., 2017). Es van realitzar proves de permutació per identificar els gens del metabolisme i la producció de PPA que eren significativament més abundants en cada tipus de mostra. Es van realitzar mil permutacions per a cada gen analitzat. Es va utilitzar un valor p de 0,05 com a tall per determinar la significació estadística. Les anotacions funcionals es van assignar a gens individuals dins d'un clúster basant-se en les anotacions de gens representatius dins del clúster. Els tàxons associats amb el metabolisme del PPA i/o la producció de PPA es van poder identificar fent coincidir els ID de contig dels fitxers de sortida de Kraken2 amb els mateixos ID de contig conservats durant l'anotació funcional mitjançant eggNOG. Les proves de significació es van realitzar mitjançant la prova U de Mann-Whitney descrita anteriorment. La correcció per a proves múltiples es va realitzar mitjançant el procediment de Benjamini-Hochberg. Es va utilitzar un valor p de ≤ 0,05 com a tall per determinar la significació estadística.
La diversitat del microbioma intestinal dels ratolins es va avaluar mitjançant l'índex de diversitat de Simpson. No es van observar diferències significatives entre les mostres de control i les de PPA pel que fa a la diversitat de gènere i espècie (valor p per al gènere: 0,18, valor p per a l'espècie: 0,16) (Figura 1). A continuació, es va comparar la composició microbiana mitjançant l'anàlisi de components principals (PCA). La figura 2 mostra l'agrupació de mostres per fílums, cosa que indica que hi havia diferències en la composició d'espècies dels microbiomes entre les mostres de PPA i les de control. Aquesta agrupació va ser menys pronunciada a nivell de gènere, cosa que suggereix que el PPA afecta certs bacteris (Figura suplementària 1).
Figura 1. Diversitat alfa de gèneres i composició d'espècies del microbioma intestinal del ratolí. Diagrames de caixa que mostren els índexs de diversitat de Simpson dels gèneres (A) i les espècies (B) en mostres de PPA i control. La significació es va determinar mitjançant la prova U de Mann-Whitney i es va realitzar una correcció múltiple mitjançant el procediment de Benjamini-Hochberg. ns, el valor p no va ser significatiu (p>0,05).
Figura 2. Resultats de l'anàlisi de components principals de la composició del microbioma intestinal del ratolí a nivell d'espècie. El gràfic de l'anàlisi de components principals mostra la distribució de les mostres entre els seus dos primers components principals. Els colors indiquen el tipus de mostra: els ratolins exposats al PPA són de color porpra i els ratolins de control són grocs. Els components principals 1 i 2 es representen a l'eix x i a l'eix y, respectivament, i s'expressen com la seva relació de variància explicada.
Utilitzant dades de recompte transformades per RLE, es va observar una disminució significativa en la relació mitjana de Bacteroidetes/Bacils en ratolins de control i PPA (control: 9,66, PPA: 3,02; valor p = 0,0011). Aquesta diferència es va deure a una major abundància de Bacteroidetes en ratolins PPA en comparació amb els controls, tot i que la diferència no va ser significativa (CLR mitjana de control: 5,51, CLR mitjana de PPA: 6,62; valor p = 0,054), mentre que l'abundància de Bacteroidetes va ser similar (CLR mitjana de control: 7,76, CLR mitjana de PPA: 7,60; valor p = 0,18).
L'anàlisi de l'abundància dels membres taxonòmics del microbioma intestinal va revelar que 1 fílum i 77 espècies difereixen significativament entre les mostres de PPA i les de control (Taula suplementària 2). L'abundància de 59 espècies en les mostres de PPA va ser significativament més alta que la de les mostres de control, mentre que l'abundància de només 16 espècies en les mostres de control va ser més alta que la de les mostres de PPA (Figura 3).
Figura 3. Abundància diferencial de tàxons en el microbioma intestinal de ratolins PPA i control. Els gràfics de volcans mostren diferències en l'abundància de gèneres (A) o espècies (B) entre les mostres de PPA i control. Els punts grisos no indiquen cap diferència significativa en l'abundància de tàxons. Els punts de colors indiquen diferències significatives en l'abundància (valor p ≤ 0,05). Els 20 tàxons principals amb les majors diferències en abundància entre els tipus de mostra es mostren en vermell i blau clar (mostres de control i PPA), respectivament. Els punts grocs i morats eren almenys 2,7 vegades més abundants en les mostres de control o PPA que en els controls. Els punts negres representen tàxons amb abundàncies significativament diferents, amb diferències mitjanes de CLR entre -1 i 1. Els valors P es van calcular mitjançant la prova U de Mann-Whitney i es van corregir per a proves múltiples mitjançant el procediment de Benjamini-Hochberg. Les diferències mitjanes de CLR en negreta indiquen diferències significatives en l'abundància.
Després d'analitzar la composició microbiana intestinal, vam realitzar una anotació funcional del microbioma. Després de filtrar els gens de baixa qualitat, es van identificar un total de 378.355 gens únics en totes les mostres. L'abundància transformada d'aquests gens es va utilitzar per a l'anàlisi de components principals (PCA), i els resultats van mostrar un alt grau d'agrupació dels tipus de mostres en funció dels seus perfils funcionals (Figura 4).
Figura 4. Resultats de l'anàlisi de la variància per ratolí (PCA) utilitzant el perfil funcional del microbioma intestinal del ratolí. El gràfic de l'anàlisi de la PCA mostra la distribució de les mostres entre els seus dos primers components principals. Els colors indiquen el tipus de mostra: els ratolins exposats al PPA són de color porpra i els ratolins de control són de color groc. Els components principals 1 i 2 es representen a l'eix x i a l'eix y, respectivament, i s'expressen com la seva relació de variància explicada.
A continuació, vam examinar l'abundància de knockouts KEGG en diferents tipus de mostres. Es van identificar un total de 3648 knockouts únics, dels quals 196 eren significativament més abundants en mostres de control i 106 eren més abundants en mostres de PPA (Figura 5). Es van detectar un total de 145 gens en mostres de control i 61 gens en mostres de PPA, amb abundàncies significativament diferents. Les vies relacionades amb el metabolisme dels lípids i els aminosucres estaven significativament més enriquides en mostres de PPA (Taula suplementària 3). Les vies relacionades amb el metabolisme del nitrogen i els sistemes de relé del sofre estaven significativament més enriquides en mostres de control (Taula suplementària 3). L'abundància de gens relacionats amb el metabolisme dels aminosucres/nucleòtids (ko:K21279) i el metabolisme del fosfat d'inositol (ko:K07291) va ser significativament més alta en mostres de PPA (Figura 5). Les mostres de control tenien significativament més gens relacionats amb el metabolisme del benzoat (ko:K22270), el metabolisme del nitrogen (ko:K00368) i la glucòlisi/gluconeogènesi (ko:K00131) (Figura 5).
Fig. 5. Abundància diferencial de KOs en el microbioma intestinal de ratolins PPA i control. El diagrama del volcà representa les diferències en l'abundància de grups funcionals (KOs). Els punts grisos indiquen KOs l'abundància dels quals no era significativament diferent entre els tipus de mostra (valor p > 0,05). Els punts de colors indiquen diferències significatives en l'abundància (valor p ≤ 0,05). Els 20 KOs amb les majors diferències en l'abundància entre els tipus de mostra es mostren en vermell i blau clar, corresponents a mostres de control i PPA, respectivament. Els punts grocs i morats indiquen KOs que eren almenys 2,7 vegades més abundants en mostres de control i PPA, respectivament. Els punts negres indiquen KOs amb abundàncies significativament diferents, amb diferències mitjanes de CLR entre -1 i 1. Els valors de P es van calcular mitjançant la prova U de Mann-Whitney i es van ajustar per a comparacions múltiples mitjançant el procediment de Benjamini-Hochberg. NaN indica que el KO no pertany a una via en KEGG. Els valors mitjans de diferència de CLR en negreta indiquen diferències significatives en l'abundància. Per obtenir informació detallada sobre les vies a les quals pertanyen els KO enumerats, vegeu la Taula suplementària 3.
Entre els gens anotats, 1601 gens tenien abundàncies significativament diferents entre els tipus de mostra (p ≤ 0,05), i cada gen era almenys 2,7 vegades més abundant. D'aquests gens, 4 gens eren més abundants en mostres de control i 1597 gens eren més abundants en mostres de PPA. Com que el PPA té propietats antimicrobianes, vam examinar les abundàncies dels gens del metabolisme i la producció de PPA entre els tipus de mostra. Entre els 1332 gens relacionats amb el metabolisme del PPA, 27 gens eren significativament més abundants en mostres de control i 12 gens eren més abundants en mostres de PPA. Entre els 223 gens relacionats amb la producció de PPA, 1 gen era significativament més abundant en mostres de PPA. La figura 6A demostra encara més la major abundància de gens implicats en el metabolisme del PPA, amb una abundància significativament més alta en mostres de control i grans mides d'efecte, mentre que la figura 6B destaca gens individuals amb una abundància significativament més alta observada en mostres de PPA.
Fig. 6. Abundància diferencial de gens relacionats amb el PPA al microbioma intestinal del ratolí. Els gràfics de volcans mostren les diferències en l'abundància de gens associats amb el metabolisme del PPA (A) i la producció de PPA (B). Els punts grisos indiquen gens l'abundància dels quals no era significativament diferent entre els tipus de mostra (valor p > 0,05). Els punts de colors indiquen diferències significatives en l'abundància (valor p ≤ 0,05). Els 20 gens amb les diferències més grans en l'abundància es mostren en vermell i blau clar (mostres de control i PPA), respectivament. L'abundància de punts grocs i morats va ser almenys 2,7 vegades més gran en les mostres de control i PPA que en les mostres de control. Els punts negres representen gens amb abundàncies significativament diferents, amb diferències mitjanes de CLR entre -1 i 1. Els valors de P es van calcular mitjançant la prova U de Mann-Whitney i es van corregir per a comparacions múltiples mitjançant el procediment de Benjamini-Hochberg. Els gens corresponen a gens representatius del catàleg de gens no redundants. Els noms dels gens consisteixen en el símbol KEGG que denota un gen KO. Les diferències mitjanes de CLR en negreta indiquen abundàncies significativament diferents. Un guió (-) indica que no hi ha cap símbol per al gen a la base de dades KEGG.
Els tàxons amb gens relacionats amb el metabolisme i/o la producció de PPA es van identificar fent coincidir la identitat taxonòmica dels contigs amb l'ID de contig del gen. A nivell de gènere, es van trobar 130 gèneres amb gens relacionats amb el metabolisme del PPA i 61 gèneres amb gens relacionats amb la producció de PPA (Taula suplementària 4). Tanmateix, cap gènere va mostrar diferències significatives en l'abundància (p > 0,05).
A nivell d'espècie, es va trobar que 144 espècies bacterianes tenien gens associats amb el metabolisme del PPA i 68 espècies bacterianes tenien gens associats amb la producció de PPA (Taula suplementària 5). Entre els metabolitzadors de PPA, vuit bacteris van mostrar augments significatius en abundància entre els tipus de mostra, i tots van mostrar canvis significatius en l'efecte (Taula suplementària 6). Tots els metabolitzadors de PPA identificats amb diferències significatives en l'abundància eren més abundants en les mostres de PPA. La classificació a nivell d'espècie va revelar representants de gèneres que no difereixen significativament entre els tipus de mostra, incloent-hi diverses espècies de Bacteroides i Ruminococcus, així com Duncania dubois, Myxobacterium enterica, Monococcus pectinolyticus i Alcaligenes polymorpha. Entre els bacteris productors de PPA, quatre bacteris van mostrar diferències significatives en l'abundància entre els tipus de mostra. Les espècies amb diferències significatives en l'abundància van incloure Bacteroides novorossi, Duncania dubois, Myxobacterium enteritidis i Ruminococcus bovis.
En aquest estudi, vam examinar els efectes de l'exposició al PPA sobre la microbiota intestinal de ratolins. El PPA pot provocar diferents respostes en els bacteris perquè és produït per certes espècies, utilitzat com a font d'aliment per altres espècies o té efectes antimicrobians. Per tant, la seva addició a l'entorn intestinal mitjançant suplements dietètics pot tenir efectes diferents depenent de la tolerància, la susceptibilitat i la capacitat d'utilitzar-lo com a font de nutrients. Les espècies bacterianes sensibles poden ser eliminades i substituïdes per aquelles que són més resistents al PPA o capaces d'utilitzar-lo com a font d'aliment, cosa que provoca canvis en la composició de la microbiota intestinal. Els nostres resultats van revelar diferències significatives en la composició microbiana, però cap efecte sobre la diversitat microbiana general. Els efectes més grans es van observar a nivell d'espècie, amb més de 70 tàxons significativament diferents en abundància entre les mostres de PPA i les de control (Taula suplementària 2). Una avaluació més detallada de la composició de les mostres exposades al PPA va revelar una major heterogeneïtat de les espècies microbianes en comparació amb les mostres no exposades, cosa que suggereix que el PPA pot millorar les característiques de creixement bacterià i limitar les poblacions bacterianes que poden sobreviure en entorns rics en PPA. Per tant, el PPA pot induir canvis selectivament en lloc de causar una disrupció generalitzada de la diversitat de la microbiota intestinal.
Anteriorment, s'ha demostrat que els conservants alimentaris com el PPA alteren l'abundància dels components del microbioma intestinal sense afectar la diversitat general (Nagpal et al., 2021). Aquí, vam observar les diferències més sorprenents entre les espècies de Bacteroidetes dins del fílum Bacteroidetes (anteriorment conegut com a Bacteroidetes), que es van enriquir significativament en ratolins exposats al PPA. L'augment de l'abundància d'espècies de Bacteroides s'associa amb un augment de la degradació del moc, que pot augmentar el risc d'infecció i promoure la inflamació (Cornick et al., 2015; Desai et al., 2016; Penzol et al., 2019). Un estudi va trobar que els ratolins mascles neonats tractats amb Bacteroides fragilis presentaven comportaments socials que recorden el trastorn de l'espectre autista (TEA) (Carmel et al., 2023), i altres estudis han demostrat que les espècies de Bacteroides poden alterar l'activitat immunitària i conduir a una cardiomiopatia inflamatòria autoimmune (Gil-Cruz et al., 2019). Les espècies pertanyents als gèneres Ruminococcus, Prevotella i Parabacteroides també van augmentar significativament en ratolins exposats a PPA (Coretti et al., 2018). Certes espècies de Ruminococcus s'associen amb malalties com la malaltia de Crohn a través de la producció de citocines proinflamatòries (Henke et al., 2019), mentre que les espècies de Prevotella com Prevotella humani s'associen amb malalties metabòliques com la hipertensió i la sensibilitat a la insulina (Pedersen et al., 2016; Li et al., 2017). Finalment, vam trobar que la proporció de Bacteroidetes (anteriorment coneguts com a Firmicutes) respecte a Bacteroidetes era significativament menor en ratolins exposats a PPA que en ratolins de control a causa d'una major abundància total d'espècies de Bacteroidetes. Anteriorment s'ha demostrat que aquesta proporció és un indicador important de l'homeòstasi intestinal, i les alteracions en aquesta proporció s'han associat amb diversos estats de malaltia (Turpin et al., 2016; Takezawa et al., 2021; An et al., 2023), incloses les malalties inflamatòries intestinals (Stojanov et al., 2020). Col·lectivament, les espècies del fílum Bacteroidetes semblen estar més afectades per un PPA dietètic elevat. Això pot ser degut a una major tolerància al PPA o a la capacitat d'utilitzar el PPA com a font d'energia, cosa que s'ha demostrat que és certa per a almenys una espècie, Hoylesella enocea (Hitch et al., 2022). Alternativament, l'exposició materna al PPA pot millorar el desenvolupament fetal fent que l'intestí de les cries de ratolí sigui més susceptible a la colonització per Bacteroidetes; tanmateix, el disseny del nostre estudi no va permetre aquesta avaluació.
L'avaluació del contingut metagenòmic va revelar diferències significatives en l'abundància de gens associats amb el metabolisme i la producció de PPA, amb ratolins exposats al PPA que presentaven una major abundància de gens responsables de la producció de PPA, mentre que els ratolins no exposats al PPA presentaven una major abundància de gens responsables del metabolisme del PAA (Figura 6). Aquests resultats suggereixen que l'efecte del PPA sobre la composició microbiana pot no ser degut únicament al seu ús, ja que en cas contrari, l'abundància de gens associats amb el metabolisme del PPA hauria d'haver mostrat una major abundància en el microbioma intestinal dels ratolins exposats al PPA. Una explicació és que el PPA media l'abundància bacteriana principalment a través dels seus efectes antimicrobians en lloc del seu ús pels bacteris com a nutrient. Estudis anteriors han demostrat que el PPA inhibeix el creixement de Salmonella Typhimurium de manera dependent de la dosi (Jacobson et al., 2018). L'exposició a concentracions més altes de PPA pot seleccionar bacteris que són resistents a les seves propietats antimicrobianes i que no necessàriament poden metabolitzar-lo o produir-lo. Per exemple, diverses espècies de Parabacteroides van mostrar una abundància significativament més alta en mostres de PPA, però no es van detectar gens relacionats amb el metabolisme o la producció de PPA (Taules suplementàries 2, 4 i 5). A més, la producció de PPA com a subproducte de fermentació està àmpliament distribuïda entre diversos bacteris (Gonzalez-Garcia et al., 2017). Una major diversitat bacteriana pot ser la raó de la major abundància de gens relacionats amb el metabolisme del PPA en mostres de control (Averina et al., 2020). A més, només es va predir que 27 (2,14%) dels 1332 gens eren gens associats exclusivament amb el metabolisme del PPA. Molts gens associats amb el metabolisme del PPA també estan implicats en altres vies metabòliques. Això demostra encara més que l'abundància de gens implicats en el metabolisme del PPA era més alta en les mostres de control; aquests gens poden funcionar en vies que no resulten en la utilització o formació de PPA com a subproducte. En aquest cas, només un gen associat amb la generació de PPA va mostrar diferències significatives en l'abundància entre els tipus de mostra. A diferència dels gens associats amb el metabolisme del PPA, es van seleccionar gens marcadors per a la producció de PPA perquè estan directament implicats en la via bacteriana de la producció de PPA. En ratolins exposats al PPA, es va trobar que totes les espècies tenien una abundància i una capacitat significativament més grans per produir PPA. Això recolza la predicció que els PPA seleccionarien productors de PPA i, per tant, prediuen que la capacitat de producció de PPA augmentaria. Tanmateix, l'abundància de gens no es correlaciona necessàriament amb l'expressió gènica; per tant, tot i que l'abundància de gens associats amb el metabolisme del PPA és més alta en mostres de control, la taxa d'expressió pot ser diferent (Shi et al., 2014). Per confirmar la relació entre la prevalença de gens productors de PPA i la producció de PPA, calen estudis de l'expressió dels gens implicats en la producció de PPA.
L'anotació funcional dels metagenomes PPA i de control va revelar algunes diferències. L'anàlisi PCA del contingut gènic va revelar clústers discrets entre les mostres de PPA i de control (Figura 5). L'agrupació dins de la mostra va revelar que el contingut del gen de control era més divers, mentre que les mostres de PPA s'agrupaven. L'agrupació per contingut gènic era comparable a l'agrupació per composició d'espècies. Per tant, les diferències en l'abundància de les vies són consistents amb els canvis en l'abundància d'espècies i soques específiques dins d'elles. En les mostres de PPA, dues vies amb una abundància significativament més alta estaven relacionades amb el metabolisme dels aminosucres/nucleòtids (ko:K21279) i múltiples vies del metabolisme lipídic (ko:K00647, ko:K03801; Taula suplementària 3). Se sap que els gens associats amb ko:K21279 estan associats amb el gènere Bacteroides, un dels gèneres amb un nombre significativament més alt d'espècies en les mostres de PPA. Aquest enzim pot evadir la resposta immunitària expressant polisacàrids capsulars (Wang et al., 2008). Això pot explicar l'augment de Bacteroidetes observat en ratolins exposats al PPA. Això complementa l'augment de la síntesi d'àcids grassos observat en el microbioma del PPA. Els bacteris utilitzen la via FASIIko:K00647 (fabB) per produir àcids grassos, que poden influir en les vies metabòliques de l'hoste (Yao i Rock, 2015; Johnson et al., 2020), i els canvis en el metabolisme dels lípids poden tenir un paper en el neurodesenvolupament (Yu et al., 2020). Una altra via que va mostrar una major abundància en mostres de PPA va ser la biosíntesi d'hormones esteroides (ko:K12343). Hi ha cada cop més evidència que hi ha una relació inversa entre la capacitat de la microbiota intestinal per influir en els nivells hormonals i per ser influenciada per les hormones, de manera que els nivells elevats d'esteroides poden tenir conseqüències per a la salut posteriors (Tetel et al., 2018).
Aquest estudi no està exempt de limitacions i consideracions. Una distinció important és que no vam realitzar avaluacions fisiològiques dels animals. Per tant, no és possible concloure directament si els canvis en el microbioma estan associats amb alguna malaltia. Una altra consideració és que els ratolins d'aquest estudi van rebre la mateixa dieta que les seves mares. Estudis futurs poden determinar si el canvi d'una dieta rica en PPA a una dieta sense PPA millora els seus efectes sobre el microbioma. Una limitació del nostre estudi, com de molts altres, és la mida limitada de la mostra. Tot i que es poden extreure conclusions vàlides, una mida de mostra més gran proporcionaria una major potència estadística a l'hora d'analitzar els resultats. També som prudents a l'hora d'extreure conclusions sobre una associació entre els canvis en el microbioma intestinal i qualsevol malaltia (Yap et al., 2021). Factors de confusió com l'edat, el sexe i la dieta poden influir significativament en la composició dels microorganismes. Aquests factors poden explicar les inconsistències observades a la literatura pel que fa a l'associació del microbioma intestinal amb malalties complexes (Johnson et al., 2019; Lagod i Naser, 2023). Per exemple, s'ha demostrat que els membres del gènere Bacteroidetes augmenten o disminueixen en animals i humans amb TEA (Angelis et al., 2013; Kushak et al., 2017). De la mateixa manera, estudis sobre la composició intestinal en pacients amb malalties inflamatòries intestinals han trobat tant augments com disminucions en els mateixos tàxons (Walters et al., 2014; Forbes et al., 2018; Upadhyay et al., 2023). Per limitar l'impacte del biaix de gènere, vam intentar garantir una representació igualitària dels sexes de manera que les diferències probablement fossin impulsades per la dieta. Un repte de l'anotació funcional és l'eliminació de seqüències gèniques redundants. El nostre mètode d'agrupació gènica requereix un 95% d'identitat de seqüència i un 85% de similitud de longitud, així com una cobertura d'alineació del 90% per eliminar la falsa agrupació. Tanmateix, en alguns casos, vam observar COG amb les mateixes anotacions (per exemple, MUT) (Fig. 6). Calen més estudis per determinar si aquests ortòlegs són diferents, s'associen a gèneres específics o si això és una limitació de l'enfocament d'agrupació de gens. Una altra limitació de l'anotació funcional és la possible classificació errònia; el gen bacterià mmdA és un enzim conegut que participa en la síntesi de propionat, però KEGG no l'associa amb la via metabòlica del propionat. En canvi, els ortòlegs scpB i mmcD estan relacionats. El gran nombre de gens sense knockouts designats pot provocar una incapacitat per identificar gens relacionats amb el PPA a l'hora d'avaluar l'abundància de gens. Els estudis futurs es beneficiaran de l'anàlisi del metatranscriptoma, que pot proporcionar una comprensió més profunda de les característiques funcionals de la microbiota intestinal i vincular l'expressió gènica amb possibles efectes posteriors. Per a estudis que impliquen trastorns neurodesenvolupament específics o malalties inflamatòries intestinals, calen avaluacions fisiològiques i de comportament dels animals per vincular els canvis en la composició del microbioma amb aquests trastorns. Estudis addicionals que trasplantin el microbioma intestinal a ratolins lliures de gèrmens també serien útils per determinar si el microbioma és un impulsor o una característica de la malaltia.
En resum, hem demostrat que el PPA dietètic actua com a factor d'alteració de la composició de la microbiota intestinal. El PPA és un conservant aprovat per la FDA que es troba àmpliament en diversos aliments que, després d'una exposició a llarg termini, pot provocar la alteració de la flora intestinal normal. Hem trobat canvis en l'abundància de diversos bacteris, cosa que suggereix que el PPA pot influir en la composició de la microbiota intestinal. Els canvis en la microbiota poden provocar canvis en els nivells de certes vies metabòliques, cosa que pot provocar canvis fisiològics rellevants per a la salut de l'hoste. Calen més estudis per determinar si els efectes del PPA dietètic sobre la composició microbiana poden provocar disbiosi o altres malalties. Aquest estudi estableix les bases per a futurs estudis sobre com els efectes del PPA sobre la composició intestinal poden afectar la salut humana.
Els conjunts de dades presentats en aquest estudi estan disponibles en repositoris en línia. El nom del repositori i el número d'accés són: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/, PRJNA1092431.
Aquest estudi amb animals va ser aprovat pel Comitè Institucional de Cura i Ús d'Animals de la Universitat de Florida Central (UCF-IACUC) (Número de permís d'ús d'animals: PROTO202000002). Aquest estudi compleix amb les lleis, regulacions i requisits institucionals locals.
NG: Conceptualització, Curació de dades, Anàlisi formal, Investigació, Metodologia, Programari, Visualització, Escriptura (esborrany original), Escriptura (revisió i edició). LA: Conceptualització, Curació de dades, Metodologia, Recursos, Escriptura (revisió i edició). SH: Anàlisi formal, Programari, Escriptura (revisió i edició). SA: Investigació, Escriptura (revisió i edició). Jutge en cap: Investigació, Escriptura (revisió i edició). SN: Conceptualització, Administració de projectes, Recursos, Supervisió, Escriptura (revisió i edició). TA: Conceptualització, Administració de projectes, Supervisió, Escriptura (revisió i edició).
Els autors declaren que no van rebre cap suport financer per a la recerca, l'autoria i/o la publicació d'aquest article.
Els autors declaren que la recerca es va dur a terme sense cap relació comercial o financera que es pogués interpretar com un possible conflicte d'interessos. No aplicable.
Totes les opinions expressades en aquest article són únicament les dels autors i no reflecteixen necessàriament els punts de vista de les seves institucions, editors, editors o revisors. Els productes avaluats en aquest article, ni les afirmacions fetes pels seus fabricants, no estan garantits ni avalats per l'editor.
Podeu trobar material complementari per a aquest article en línia: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/frmbi.2024.1451735/full#supplementary-material
Abdelli LS, Samsam A, Nasser SA (2019). L'àcid propiònic indueix gliosi i neuroinflamació mitjançant la regulació de la via PTEN/AKT en trastorns de l'espectre autista. Scientific reports 9, 8824–8824. doi: 10.1038/s41598-019-45348-z
Aitchison, J. (1982). Anàlisi estadística de dades de composició. JR Stat Soc Ser B Methodol. 44, 139–160. doi: 10.1111/j.2517-6161.1982.tb01195.x
Ahn J, Kwon H, Kim YJ (2023). La relació Firmicutes/Bacteroidetes com a factor de risc per al càncer de mama. Journal of Clinical Medicine, 12, 2216. doi: 10.3390/jcm12062216
Anders S., Huber W. (2010). Anàlisi d'expressió diferencial de dades de recompte de seqüències. Nat Prev. 1–1, 1–10. doi: 10.1038/npre.2010.4282.1
Angelis, MD, Piccolo, M., Vannini, L., Siragusa, S., Giacomo, AD, Serrazanetti, DI, et al. (2013). Microbiota fecal i metaboloma en nens amb autisme i trastorn generalitzat del desenvolupament no especificat d'una altra manera. PloS One 8, e76993. doi: 10.1371/journal.pone.0076993
Averina OV, Kovtun AS, Polyakova SI, Savilova AM, Rebrikov DV, Danilenko VN (2020). Característiques neurometabòliques bacterianes de la microbiota intestinal en nens petits amb trastorns de l'espectre autista. Journal of Medical Microbiology 69, 558–571. doi: 10.1099/jmm.0.001178
Baquero F., Nombela K. (2012). El microbioma com a òrgan humà. Microbiologia Clínica i Infecció 18, 2–4. doi: 10.1111/j.1469-0691.2012.03916.x
Baur T., Dürre P. (2023). Noves perspectives sobre la fisiologia dels bacteris productors d'àcid propiònic: Anaerotignum propionicum i Anaerotignum neopropionicum (anteriorment Clostridium propionicum i Clostridium neopropionicum). Microorganismes 11, 685. doi: 10.3390/microorganismes11030685
Bazer FW, Spencer TE, Wu G, Cudd TA, Meininger SJ (2004). Nutrició materna i desenvolupament fetal. J Nutr. 134, 2169–2172. doi: 10.1093/jn/134.9.2169
Benjamini, Y., i Hochberg, J. (1995). Control de la taxa de falsos positius: un enfocament pràctic i eficient per a les proves múltiples. JR Stat Soc Ser B Methodol. 57, 289–300. doi: 10.1111/j.2517-6161.1995.tb02031.x
Data de publicació: 18 d'abril de 2025