Gràcies per visitar Nature.com. La versió del navegador que esteu utilitzant té compatibilitat limitada amb CSS. Per a una millor experiència, us recomanem que utilitzeu un navegador actualitzat (o que desactiveu el mode de compatibilitat a l'Internet Explorer). Mentrestant, per garantir una assistència continuada, mostrarem el lloc web sense estils ni JavaScript.
A diferència dels vertebrats, es creu que els insectes no tenen hormones esteroides sexuals amb esbiaix masculí. En *Anopheles gambiae*, l'esteroide ecdisona 20-hidroxiecdisona (20E) sembla haver evolucionat per controlar el desenvolupament dels ous quan són sintetitzats per les femelles2 i per induir un període refractari d'aparellament quan són transferits sexualment pels mascles3. Com que el desenvolupament i l'aparellament dels ous són trets reproductius essencials, comprendre com les femelles de mosquit *Anopheles* integren aquests senyals hormonals podria facilitar el disseny de nous programes de control de la malària. Aquí, revelem que aquestes funcions reproductives estan regulades per diferents esteroides sexuals a través d'una xarxa complexa d'enzims activadors/inactivadors d'ecdisteroides. Vam identificar una ecdisona oxidada específica del mascle, la 3-deshidro-20E (3D20E), que protegeix la filiació tancant la receptivitat sexual femenina després de la transferència sexual i l'activació per desfosforilació. En particular, la transferència de 3D20E també va induir l'expressió de gens reproductius que mantenen el desenvolupament dels ous durant la infecció per Plasmodium, garantint la salut de les femelles infectades. La 20E derivada de la femella no provoca una infecció sexual. resposta, però permet que els individus en aparellament posi ous després que s'inhibeixin les cinases inhibidores de 20E. La identificació d'aquesta hormona esteroide d'insectes específica del mascle i el seu paper en la regulació de la receptivitat sexual femenina, la fertilitat i la interacció amb Plasmodium suggereix el potencial de reduir l'èxit reproductiu dels mosquits transmissors de la malària.
Els casos i les morts per malària tornen a augmentar4 a causa de la resistència generalitzada als insecticides en els mosquits Anopheles, l'únic vector dels paràsits de la malària humana. La biologia d'aparellament d'aquests mosquits és un objectiu particularment atractiu per a noves intervencions de control de la malària, ja que les femelles només s'aparellen una vegada5; fer que aquest únic esdeveniment d'aparellament sigui estèril tindria un gran potencial per reduir les poblacions de mosquits al camp.
Les dones queden sexualment incapacitades després de rebre hormones esteroides d'alt títol dels homes. Els estudis han demostrat que el desencadenant de la dificultat per a l'aparellament posterior és la 20-hidroxiecdisona (20E), una hormona esteroide més coneguda com a reguladora del cicle de muda en l'etapa larvària. La capacitat dels mascles per sintetitzar i transferir 20E ha evolucionat específicament en espècies d'Anopheles que formen part del subgènere Cellia7, que es distribueix a l'Àfrica i inclou els vectors més perillosos de la malària, inclòs Anopheles gambiae. Això és especialment notable perquè en aquestes espècies les femelles també produeixen 20E després de cada àpat de sang, i el 20E impulsa el cicle de l'oogènesi (vegeu la ref. 8). Tanmateix, se sap poc sobre la manera com les femelles integren senyals de dues fonts diferents d'ecdisona (transferència de mascles i inducció de l'alimentació sanguínia) sense comprometre la seva pròpia capacitat d'aparellament. De fet, si el 20E produït per les femelles desencadena intolerància sexual, això conduirà a la infertilitat en individus que s'alimenten verges, un comportament molt comú en aquests mosquits5.
Una possible explicació és que els mascles d'A. gambiae transfereixen una ecdisona específica del mascle modificada, que activa una cascada de senyalització al tracte reproductor femení, cosa que provoca inestabilitat en l'aparellament. Tanmateix, tot i que els vertebrats tenen múltiples hormones esteroides, com ara estrògens i andrògens (revisades a la referència 9), segons el nostre coneixement, no s'han identificat esteroides amb esbiaix androgènic en insectes.
Ens vam proposar determinar el repertori d'hormones esteroides a la glàndula accessòria masculina (MAG) d'A. gambiae sexualment madura a la recerca de possibles esteroides modificadors. Mitjançant cromatografia líquida d'alta resolució acoblada amb espectrometria de masses en tàndem (HPLC-MS/MS) en lloc del mètode menys específic utilitzat anteriorment, vam detectar ecdisona (E) i 20E en aquest teixit, confirmant el resultat anterior. Tanmateix, la mostra estava dominada per esteroides fosforilats oxidats, d'acord amb la fórmula 3-deshidro-20E-22-fosfat (3D20E22P)12 (Figura 1). Altres formes inclouen 3-deshidro-20E (3D20E) i 20E-22-fosfat (20E22P). La intensitat del senyal HPLC-MS/MS de 3D20E22P era dos ordres de magnitud superior a la de la seva forma desfosforilada, 3D20E, i tres ordres de magnitud superior a la d'E i 20E (Figura 1). Tot i que en altres parts del cos i la part inferior tracte reproductor (LRT; dades ampliades Fig. 1a). També vam analitzar ecdisteroides en mascles i femelles recentment tancats (<1 dia d'edat) i vam detectar 3D20E i 3D20E22P només en MAG; E, 20E i 20E22P eren presents en ambdós sexes (dades ampliades Fig. 1b). Aquestes dades suggereixen que els mascles adults d'A. gambiae produeixen alts títols d'hormones modificadores en els seus MAG que no són sintetitzades per les femelles.
Es van disseccionar MAG i LRT femenina (incloses les aurícules, les vesícules seminals i el parovari) de mascles verges de 4 dies d'edat i femelles verges i aparellades (0,5, 3 i 12 hpm). L'ecdisona en aquests teixits es va analitzar mitjançant HPLC-MS/MS (mitjana ± sem; prova t no aparellada, bilateral, taxa de descobriment fals (FDR) corregida; NS, no significatiu; *P < 0,05, **P < 0,01. 3D20E: 3 hores vs. 0,5 hores, P = 0,035; 12 hores vs. 3 hores, P = 0,0015; 12 hores vs. 0,5 hores, P = 0,030. 3D20E22P: 3 hores vs. 0,5 hores, P = 0,25; 12 hores vs. 3 hores, P = 0,0032; 12 hores vs. 0,5 hores, P = 0,015). Les dades provenen de tres rèpliques biològiques. L'àrea del pic per a cada ecdisona d'interès es va calcular i normalitzar pel nombre de mosquits. L'ecdisona es representa pel color següent: E, verd; 20E, taronja; 20E22P, morat; 3D20E, blau; 3D20E22P, rosa. El requadre augmenta l'escala a l'eix y per mostrar nivells més baixos d'ecdisona.
Per investigar si 3D20E22P i 3D20E es transfereixen durant l'aparellament, vam disseccionar LRT femelles en diversos moments després de l'aparellament. Tot i que no es va trobar ecdisona en verges, vam observar quantitats substancials de 3D20E22P a la LRT immediatament després de l'aparellament (0,5 h després de l'aparellament, hpm), disminuint amb el temps, mentre que els nivells de 3D20E van augmentar significativament (Fig. 1). Utilitzant 3D20E sintetitzat químicament com a estàndard, vam determinar que els nivells d'aquesta hormona esteroide en les LRT d'aparellament eren almenys 100 vegades més alts que els de 20E (Taula de dades ampliades 1). Per tant, 3D20E22P és la principal ecdisona masculina que es transfereix a la LRT femella durant l'aparellament, i la seva forma desfosforilada, 3D20E, es torna molt abundant poc després de l'aparellament. Això suggereix un paper important per a aquesta última ecdisona en la biologia posterior a l'aparellament de les femelles.
Després de generar un nou conjunt de dades de seqüenciació d'ARN (RNA-seq) (Fig. 2a), utilitzant una canonada bioinformàtica personalitzada, vam buscar l'ecdisona cinasa (EcK), l'ecdisona oxidasa (EO) i l'ecdisona que codifica el gen de la fosfatasa modificada amb 20E. L'EPP) s'expressa en teixits reproductors. Vam identificar un gen EPP candidat i dos possibles gens EcK (EcK1 i EcK2), però no vam poder trobar un bon gen EO candidat. Cal destacar que els gens EPP individuals es van expressar a nivells alts (percentil 98,9) en MAG gambians però no en LRT femenins (Fig. 2b), contràriament a les nostres expectatives, ja que la desfosforilació de 3D20E22P es va produir en aquest teixit femení. Per tant, creiem que l'EPP masculí es pot transferir durant l'aparellament. De fet, vam utilitzar el marcatge d'isòtops estables in vivo per emmascarar la proteïna femenina després de l'aparellament, un enzim identificat per MS a l'aurícula femenina (Fig. 2c i Taula suplementària 1). El La presència d'EPP en MAG i LRT femella aparellada (però no verge) també es va confirmar mitjançant anticossos específics (Fig. 2d).
a, Una canonada bioinformàtica personalitzada per cercar als teixits reproductius de cada sexe gens que codifiquen EcK, EO i EPP. Els números al costat de les fletxes indiquen el nombre de candidats masculins i femenins a cada pas. Aquesta anàlisi va identificar un gen EPP (EPP) i un gen EcK (EcK1) que s'expressen en mascles, i un gen EcK (EcK2) que s'expressa en ambdós sexes però no produeix un gen EO candidat. b, Mapa de calor que compara l'expressió de gens candidats en teixits verges (V) i d'aparellament (M) d'Anopheles gambiae i Anopheles albicans. Spca, fecundació; MAG, glàndules accessòries en mascles; altres parts del cos, incloent-hi pits, ales, potes, cossos adiposos i òrgans interns en ambdós sexes, i ovaris en femelles. L'EcK2 s'expressa molt tant en MAG com en aurícules de Gàmbia, mentre que l'EPP només es troba en MAG. c, Anàlisi proteòmica de la translocació del grup d'ejaculació masculina a les aurícules femenines a 3, 12 i 24 hpm, que mostra les 67 proteïnes més abundants. Les femelles es van criar amb una dieta que contenia 15N per marcar (i emmascarar) totes les proteïnes. Els mascles no etiquetats es van aparellar amb femelles etiquetades i les LRT femenines es van disseccionar a 3, 12 i 24 hpm per a l'anàlisi proteòmica (vegeu la Taula suplementària 1 per obtenir una llista completa de proteïnes ejaculadores). A la imatge inserida, es van detectar EPP, Eck1 i EcK2 al MAG de mascles verges mitjançant anàlisi proteòmica d'aquests teixits. d, L'EPP es va detectar mitjançant western blot en MAG i LRT de femelles aparellades, però no en femelles o mascles verges ni en la resta de la femella. cos. Les membranes es van sondar simultàniament amb anticossos anti-actina (control de càrrega) i anti-EPP. Tots els mascles són verges. Vegeu la figura suplementària 1 per a les dades de la font del gel. Es van realitzar transferències Western dues vegades amb resultats similars.
L'activitat ecdisteroide fosfofosfatasa de l'EPP es va verificar després de la incubació mitjançant HPLC-MS/MS amb 3D20E22P aïllat de MAG (Dades ampliades Fig. 2a). A més, quan vam silenciar l'EPP mitjançant interferència mediada per ARN (RNAi), vam detectar una forta reducció de l'activitat fosfatasa en els teixits reproductors d'aquests mascles (Fig. 3a), i les femelles aparellades amb mascles silenciats per EPP van mostrar una proporció significativament menor de 3D20E desfosforilat (Fig. 3b) malgrat el silenciament gènic parcial (Dades ampliades Fig. 2b,c). En canvi, no vam detectar canvis significatius en la relació 20E22P/20E en els mateixos mosquits, cosa que podria suggerir que l'enzim és específic per a 3D20E22P (Fig. 3b).
a, Disminució de l'activitat fosfatasa en MAG causada pel silenciament d'EPP mitjançant controls d'ARN EPP bicatenari (dsEPP) o ARN GFP bicatenari (dsGFP). Es van utilitzar vint grups de MAG a cada rèplica (P = 0,0046, prova t aparellada, bilateral), representats per punts separats. b, Les femelles aparellades amb mascles silenciats amb EPP tenien una proporció significativament menor de 3D20E desfosforilat a 3 hpm (P = 0,0043, prova t no aparellada, bilateral), mentre que els nivells de 20E no es van veure afectats (P = 0,063, no aparellat). Prova t, bilateral). Les dades es presenten com a mitjana ± sem de tres grups de 13, 16 i 19 femelles cadascun.c, Les femelles aparellades amb mascles silenciats amb EPP van tenir taxes de reaparellament significativament més altes (P = 0,0002, prova exacta de Fisher, bilateral). Primer es va obligar les femelles a aparellar-se per assegurar el seu estat d'aparellament; 2 dies després, es van contactar amb altres mascles portadors d'espermatozoides transgènics per avaluar les taxes de reaparellament mitjançant la detecció quantitativa per PCR del transgèn.d, les femelles alimentades amb sang i aparellades amb mascles silenciats amb EPP tenien una fertilitat significativament reduïda (P < 0,0001; prova de Mann-Whitney, bilateral) i un nombre d'ous lleugerament reduït (P = 0,088, prova de Mann-Whitney, bilateral), mentre que la taxa de fresa no es va veure afectada (P = 0,94, prova exacta de Fisher, bilateral). En tots els panells, n representa el nombre de mostres de mosquits biològicament independents. NS, no significatiu. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,001.
A continuació, vam avaluar si la desfosforilació de l'ecdisona és important per induir resistència a l'aparellament en les femelles. En particular, les femelles que es van aparellar amb mascles amb depleció de EPP es van tornar a aparellar amb una freqüència molt més alta (44,9%) que les femelles de control (10,4%) quan es van exposar a mascles (transgènics) addicionals (Fig. 3c). També vam observar una disminució significativa de la fertilitat (Fig. 3d, esquerra) i una lleugera disminució del nombre d'ous postos per aquestes femelles (Fig. 3d, centre), mentre que el percentatge d'ous postos per les femelles (una altra resposta provocada en les femelles per l'aparellament) no es va veure afectat (Fig. 3d, dreta). Donada l'especificitat observada de l'EPP per 3D20E22P, aquests resultats suggereixen que l'activació de 3D20E per l'EPP transferit durant l'aparellament pot tenir un paper important en la desactivació de la receptivitat femenina a un aparellament posterior, un comportament que anteriorment s'havia atribuït a la transferència sexual de 20E. Per tant, aquesta hormona específica del mascle també afecta fortament la fertilitat femenina.
A continuació, vam comparar les activitats de 20E i 3D20E en experiments d'injecció en verges sexualment madures utilitzant 3D20E sintetitzat químicament (Fig. 4a-c) i 20E disponible comercialment. Vam observar que 3D20E era significativament més eficaç que 20E per tancar la sensibilitat de les femelles a l'aparellament en ambdues concentracions (Fig. 4d). Cal destacar que la meitat del nivell fisiològic de 3D20E a la LRT (1.066 pg després de la injecció vs. 2.022 pg després de l'aparellament) va induir una proporció de femelles refractàries que era 20 vegades més alta que el nivell fisiològic de 20E (361 pg després de la injecció) 24 hores després de la injecció a la concentració més alta 18 pg després de l'aparellament; Taula de dades ampliades 1). Aquest resultat és coherent amb la idea que la transferència sexual de 20E no causa períodes refractaris d'aparellament, i assenyala a més a més a 3D20E com un factor important per garantir la relació pare-fill. 3D20E també va ser significativament més actiu que 20E en assaigs de posta d'ous en femelles verges (Fig. 4e), cosa que suggereix que la taxa normal de posta d'ous que vam observar després del silenciament parcial de l'EPP es devia a la presència d'activitat residual de 3D20E encara produïda per factors femenins induïts per l'aparellament.
(a, b) 3D20E sintetitzat químicament a partir de 20E (a) amb una conversió/eficiència molt alta (dades presentades com a mitjana ± sem de tres reaccions de síntesi independents) (b).c, L'espectre de masses (meitat inferior) coincideix exactament amb l'ecdisona trobada en LRT femella aparellada (meitat superior).d, En comparació amb 20E (0,63 µg, P = 0,02; 0,21 µg, P < 0,0001; prova exacta de Fisher, bilateral) i etanol al 10% (0,63 µg, P < 0,0001; 0,21 µg, P < 0,0001; prova exacta de Fisher, bilateral), mentre que 20E va ser significativament més alt que el control només a dosis més altes (0,63 µg, P = 0,0002; 0,21 µg, P = 0,54; prova exacta de Fisher, bilateral).e, 3D20E La injecció va induir taxes de desova significativament més altes en femelles verges que en els controls amb etanol al 10% (0,21 µg, P < 0,0001; 0,13 µg, P = 0,0003; prova exacta de Fisher, bilateral), mentre que 20E en comparació amb els controls només a dosis més altes (0,21 µg, P = 0,022; 0,13 µg, P = 0,0823; prova exacta de Fisher, bilateral). 3D20E va induir taxes de desova significativament més altes que 20E a dosis més altes (0,21 µg, P = 0,0019; 0,13 µg, P = 0,075; prova exacta de Fisher, bilateral). En tots els panells, n representa el nombre de mostres de mosquits biològicament independents. NS, no significatiu. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,001. Les dades provenen de tres rèpliques.
En estudis anteriors, vam determinar que la transferència sexual d'hormones esteroides indueix l'expressió de MISO (Estimulador de l'Oogènesi Induït per l'Aparell 11), un gen reproductor femení que protegeix les femelles d'A. gambiae de la infecció per P. falciparum. Costos de salut causats per 13, el paràsit de la malària humana més mortal. Donada la importància de MISO per a l'aptitud reproductiva d'Anopheles a les zones endèmiques de la malària, vam decidir determinar quina hormona 3D20E o 20E desencadena l'expressió d'aquest gen. Vam trobar que, mentre que la injecció de 20E induïa específicament o més potentment alguns receptors d'hormones nuclears (HR), com ara HR3 i HR4, i dianes esteroides típiques aigües avall, com ara els gens yolkogènics Vg14, 15, 16, MISO va ser induït amb més força per 3D20E (Dades Ampliades Fig. 3). Per tant, la transferència sexual d'aquesta hormona esteroide androgènica sembla induir mecanismes que protegeixen les femelles dels costos que planteja la infecció parasitària. A més, 3D20E afecta diferencialment ambdues isoformes del receptor E EcR, que indueixen EcR-A i reprimeixen EcR-B, i que desencadenen amb més força altres gens inductors d'aparellament, inclòs HPX15, que afecta la fertilitat femenina. Això podria explicar la infertilitat significativa observada en femelles aparellades amb mascles silenciats per EPP (Dades ampliades Fig. 3). Aquestes dades suggereixen l'existència de vies posteriors activades preferentment per dues hormones ecdisona que poden ser la base de la funció específica del sexe.
A continuació, vam provar la funció dels dos gens EcK identificats a la nostra línia de bioinformàtica. El silenciament d'EcK1 o EcK2 va provocar una mortalitat significativa en els mascles (Dades ampliades Fig. 4a), cosa que suggereix que la fosforilació de l'ecdisona, i per tant la inactivació, és important per a la supervivència. Com que EcK2 s'expressava a nivells més alts que EcK1 i es va detectar en MAG mitjançant proteòmica (Fig. 2b, c i Taula suplementària 2), vam validar la seva activitat ecdisteroide cinasa incubant-la amb 20E, cosa que va resultar en la fosforilació de 20E22P (Dades ampliades Figura 2).4b). Quan vam utilitzar 3D20E com a substrat, no vam poder detectar el producte fosforilat 3D20E22P (Dades ampliades Fig. 4c), cosa que suggereix que 20E en lloc de 3D20E pot ser l'objectiu preferit d'EcK2.
Segons la nostra anàlisi de RNA-seq, EcK2 també s'expressava molt a la LRT de femelles verges, on es desactivava després de l'aparellament (Fig. 2b). Vam confirmar aquestes dades i vam determinar que l'expressió d'EcK2 no es veia afectada per l'alimentació amb sang (Dades ampliades Fig. 5a). Ampliant els nostres experiments inicials de MS, vam determinar que el pic de 20E22P estava estretament relacionat amb el pic de 20E (22-26 hores després de l'àpat de sang; Dades ampliades Fig. 5b). El silenciament d'EcK2 en femelles verges va provocar un augment de 3 vegades en la proporció relativa de 20E a 20E22P a 26 h després de l'àpat de sang (Figures de dades ampliades 2c i 5c), confirmant que EcK2 també fosforila 20E en femelles. En particular, les verges amb depleció d'EcK2 van mantenir una receptivitat sexual completa (Dades ampliades Fig. 5d,e), cosa que suggereix encara més que la producció femenina de 20E no indueix períodes refractaris d'aparellament. Tanmateix, aquestes femelles tenien va augmentar significativament les taxes de posta d'ous en comparació amb els controls, amb més del 30% de les verges ponent ous (Dades ampliades Fig. 5f). Si es van realitzar injeccions d'ARN Eck2 de doble cadena (dsEcK2) després de l'alimentació amb sang, la posta no es va produir, moment en què el pic de 20E a causa de la ingestió de sang havia disminuït. En general, aquests resultats donen suport a un model que el 20E produït després de la xucla de sang pot induir la posta, però només quan el bloqueig de la posta (EcK2 i possiblement altres factors) es desactiva per l'aparellament. Ni les injeccions de 20E ni les de 3D20E van inhibir l'expressió d'EcK2 en verges (Dades ampliades Fig. 5g), cosa que suggereix que altres factors intervenen en la inhibició d'aquesta cinasa. Tanmateix, els nivells de 20E després de l'alimentació amb sang no van ser suficients per induir molèsties d'aparellament, sinó que van ser desencadenats eficaçment per alts títols de 3D20E transferit sexualment.
Els nostres resultats proporcionen informació important sobre els mecanismes que regulen l'èxit reproductiu d'A. gambiae. Ha sorgit un model on els mascles han evolucionat per sintetitzar alts títols de 3D20E, una ecdisona modificada específica del mascle que assegura la filiació dessensibilitzant les femelles a un aparellament posterior. Al mateix temps, aquests vectors de la malària també han desenvolupat un sistema eficient per activar 3D20E en femelles en resposta a la transferència sexual d'EPP específic del mascle. Segons el nostre coneixement, aquest és el primer exemple d'un sistema d'hormones esteroides dominat per mascles i femelles que realitza una funció única i crítica en els insectes. La funció de l'ecdisona específica del mascle s'ha postulat però no s'ha demostrat definitivament. Per exemple, una hipòtesi 18 àmpliament refutada és que aquestes funcions poden ser realitzades pel precursor 20E E1. És ben sabut que a Drosophila, la monàndria es desencadena per la transferència sexual de petits pèptids sexuals 19,20 que interactuen amb les neurones que innerven el tracte reproductor femení a través de receptors específics de pèptids sexuals 21,22. Calen més treballs per determinar les cascades de senyalització posteriors. controlat per 3D20E en femelles d'A. gambiae i determinar si aquestes cascades es poden conservar entre mosquits i Drosophila.
Donat el paper important de 3D20E en la fertilitat i el comportament femení identificats en el nostre estudi, les vies que condueixen a la síntesi i activació de 3D20E ofereixen noves oportunitats per a futures estratègies de control de mosquits, com ara la generació de mascles estèrils competitius en estratègies de tecnologia d'insectes estèrils. Ús per a l'alliberament en estat salvatge o per imitar el 3D20E en el joc verge. La funció específica del mascle de 3D20E pot haver evolucionat quan A. gambiae i altres espècies de Cellia van adquirir la capacitat de coagular el seu semen en taps d'aparellament, ja que això permet la transferència eficient d'un gran nombre d'hormones i enzims activadors d'hormones. Al seu torn, l'evolució de 3D20E que implementa la monandria proporciona un mecanisme perquè les femelles (mitjançant una alta expressió de MISO) afavoreixin la seva aptitud reproductiva en zones amb alta prevalença de malària, cosa que contribueix indirectament a la transmissió de Plasmodium. Atès que s'ha demostrat que la femella 20E té efectes profunds sobre la supervivència i el creixement de P. falciparum en mosquits Anopheles femelles,24 les vies de les hormones esteroides masculines i femenines són ara aspectes clau de les interaccions mosquit-paràsit.
Les soques G3 d'A. gambiae es van criar en condicions estàndard d'insectes (26-28 °C, humitat relativa del 65-80%, fotoperíode de llum/foscor de 12:12 h). Les larves es van alimentar amb aliment en pols per a peixos (TetraMin Tropical Flakes, Koi Pellets i Tetra Pond Sticks en una proporció de 7:7:2). Els mosquits adults es van alimentar ad libitum amb una solució de dextrosa al 10% i sang humana setmanalment (estudi de components sanguinis). Els mosquits verges es van obtenir segregant els sexes en l'etapa de pupa després d'examinar els extrems mitjançant microscòpia. Els mascles portadors del transgèn DsRed s'han descrit anteriorment.
Els experiments d'aparellament forçat es van dur a terme segons els protocols descrits anteriorment. Per a l'aparellament natural, es van mantenir femelles verges de 4 dies d'edat en una proporció d'1:3 amb mascles verges sexualment madurs durant dues nits. Per als experiments en què es va injectar dsEPP als mascles, la co-gàbia va coincidir amb els dies 3-4 posteriors a la injecció, quan l'activitat de la fosfatasa es va silenciar al màxim (Dades ampliades Fig. 2b).
Els teixits de mosquit, els cadàvers restants (resta del cos) o el cos sencer es van disseccionar en metanol al 100% i es van homogeneïtzar amb una esfera (perles de vidre de 2 mm, 2.400 rpm, 90 segons). Les quantitats de teixit i els volums de metanol van ser els següents: resta del cos, 50 en 1.000 µl; MAG, 50–100 × 80 µl; LRT femenina, 25–50 × 80 µl. El precipitat es va sotmetre a una segona extracció de metanol amb el mateix volum de metanol. Les restes cel·lulars es van eliminar per centrifugació. El metanol de les dues extraccions es va combinar i es va assecar sota flux de nitrogen, i després es va resuspendre en els següents volums de metanol al 80% en aigua: resta del cos, 50 µl; MAG i LRT femenina, 30 µl.
Les mostres es van analitzar en un espectròmetre de masses (ID-X, Thermo Fisher) acoblat a un instrument LC (Vanquish, Thermo Fisher). Es van injectar 5 µl de mostra en una columna de 3 µm i 100 × 4,6 mm (Inspire C8, Dikma) mantinguda a 25 °C. Les fases mòbils per a la LC van ser A (aigua, 0,1% d'àcid fòrmic) i B (acetonitril, 0,1% d'àcid fòrmic). El gradient de LC va ser el següent: 5% de B durant 1 minut, després es va augmentar fins al 100% de B durant 11 minuts. Després de 8 minuts al 100%, es va tornar a equilibrar la columna al 5% de B durant 4 minuts. El cabal va ser de 0,3 ml min-1. La ionització a la font MS es realitza mitjançant ionització per electroaspersió escalfada en modes positiu i negatiu.
L'espectròmetre de masses mesura dades en el rang m/z de 350 a 680 amb una resolució de 60.000 en mode MS complet. Les dades MS/MS es van adquirir en [M + H]+ (totes les dianes), [M - H2O + H]+ (totes les dianes) i [M - H]- (dianes fosforilades). Les dades MS/MS es van utilitzar per confirmar les propietats de l'ecdisona de les dianes per a les quals no hi havia cap estàndard disponible. Per identificar ecdisteroides no dirigits, es van analitzar les dades MS/MS per a tots els pics HPLC amb una abundància relativa >15%. Quantificar mitjançant corbes estàndard creades a partir d'estàndards purs (20E, 3D20E) per calcular quantitats absolutes o dilucions d'una mostra específica (totes les altres dianes) per calcular la seva equivalència amb les quantitats trobades en un mascle. Per a 3D20E, la quantificació es va realitzar mitjançant la suma dels següents adductes: [M + TFA]-, [M + COOH]-, [M + Na]+, [M + Cl]-, [M + NO3]-. Les dades es van extreure i quantificar mitjançant Tracefinder (versió 4.1). Les dades de MS/MS es van analitzar mitjançant Xcalibur (versió 4.4). Els espectres de MS de E, 20E i 3D20E es van comparar amb els respectius estàndards. El 3D20E22P es va analitzar mitjançant derivatització amb reactiu de Girard. El 20E22P es va analitzar mitjançant la relació m/z.
El 3D20E22P es va purificar a partir de MAG. La purificació es va realitzar a escala analítica utilitzant un cromatògraf de líquids d'ultra rendiment (Acquity, Waters) amb un detector quadrupol basat en masses (QDa, Acquity, Waters) en les mateixes condicions de LC que l'anàlisi HPLC-MS/MS. La recollida de fraccions es va activar quan es va detectar l'm/z corresponent al 3D20E22P al mateix temps de retenció que s'havia determinat anteriorment. La puresa dels compostos extrets es va comprovar mitjançant HPLC-MS/MS tal com s'ha descrit anteriorment.
L'ARN total es va extreure de 10-12 teixits reproductors o altres parts del cos (sense cap) utilitzant el reactiu TRI (Thermo Fisher) seguint les instruccions del fabricant. L'ARN es va tractar amb TURBO DNase (Thermo Fisher). El cDNA es va sintetitzar utilitzant la transcriptasa inversa del virus de la leucèmia murina de Moloney (M-MLV RT; Thermo Fisher) seguint les instruccions del fabricant. Els encebadors per a la PCR quantitativa de transcripció inversa (RT-qPCR; Taula de dades ampliades 2) es van publicar prèviament24 o es van dissenyar utilitzant Primer-BLAST26, donant preferència a productes de 70-150 bp de mida i que abastaven unions exó-exó o encebadors de parells d'encebadors per exons separats. Les mostres de cDNA de tres a quatre rèpliques biològiques es van diluir quatre vegades en aigua per a RT-qPCR. La quantificació es va realitzar en reaccions de rèplica de 15 µl que contenien 1× PowerUp SYBR Green Master Mix (Thermo Fisher), encebadors i 5 µl de cDNA diluït. Les reaccions es van executar en un QuantStudio 6 Pro Es va utilitzar un sistema de PCR en temps real (Thermo Fisher) i les dades es van recollir i analitzar mitjançant Design and Analysis (versió 2.4.3). Com es demostra en aquest estudi, les quantitats relatives es van normalitzar al gen ribosòmic RpL19 (AGAP004422), l'expressió del qual no va canviar significativament amb l'alimentació amb sang 27 ni l'aparellament 3.
La qualitat de l'ARN es va comprovar amb un Bioanalyzer 2100 d'Agilent (Agilent). Les biblioteques d'extrems aparellats Illumina es van preparar i executar al Broad Institute del MIT i Harvard. Les lectures de seqüenciació es van alinear amb el genoma d'A. gambiae (soca PEST, versió 4.12) utilitzant HISAT2 (versió 2.0.5) amb paràmetres predeterminats. Les lectures amb puntuacions de qualitat de mapatge (MAPQ) <30 es van eliminar mitjançant Samtools (versió 1.3.1). El nombre de lectures mapades a gens es va comptar mitjançant htseq-count (versió 0.9.1) amb paràmetres predeterminats. Es van calcular els recomptes de lectures normalitzats i es va analitzar l'expressió gènica diferencial mitjançant el paquet DESeq2 (versió 1.28.1) a R (versió 4.0.3).
Els candidats a gens modificadors d'ecdisona es van identificar cercant primer el genoma d'A. gambiae mitjançant l'algoritme PSI-BLAST (https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/2.8.1/), utilitzant valors per defecte dels paràmetres amb les següents seqüències de proteïnes de consulta: de Bombyx mori (número d'accés NP_001038956.1), Musca domestica (número d'accés XP_005182020.1, XP_005175332.1 i XP_011294434.1) i Microplitis demolitor (número d'accés XP_008552646.1 i XP_008552645.1), EcK de B. mori (número d'accés NP_001036900), Drosophila melanogaster (número d'accés NP_651202), Apis mellifera (núm. d'accés XP_394838) i Acyrthosiphon pisum (núm. d'accés XP_001947166); i EPP de B. mori (núm. d'accés XP_001947166) NP_001177919.1 i NP_001243996.1) i EO de D. melanogaster (núm. d'accés NP_572986.1) (pas 1). A continuació, filtreu els resultats basats en una alta expressió d'ARNm (>100 fragments/quilobases d'exons per milió de lectures mapades (FPKM) o >85%) en teixit reproductor (LRT femení o MAG) a Gàmbia (pas 2). Per millorar l'especificitat, vam seleccionar enzims candidats que també s'expressen en el teixit reproductor d'A. albimanus, una espècie d'anopheles que no sintetitza ni transfereix ecdisona durant l'aparellament. Els gens candidats es van filtrar en funció de la baixa expressió (<100 FPKM o
Femelles verges de 4 a 6 dies d'edat marcades amb 15N van ser obligades a aparellar-se amb mascles verges sense etiquetar de la mateixa edat. L'aparellament reeixit es va verificar detectant taps d'aparellament sota microscòpia d'epifluorescència. A 3, 12 i 24 hpm, les aurícules de 45-55 femelles aparellades es van disseccionar en 50 µl de tampó de bicarbonat d'amoni (pH 7,8) i es van homogeneïtzar amb un morter. L'homogenat es va centrifugar i el sobrenedant es va barrejar amb 50 µl de RapiGest al 0,1% (186001860, Waters) en bicarbonat d'amoni a 50 mM. El sobrenedant i el pellet de cada mostra es van congelar ràpidament en gel sec i es van enviar durant la nit al laboratori MacCoss de la Universitat de Washington, on es va completar la preparació de la mostra per a LC-MS/MS. Resuspendre el pellet en 50 µl de RapiGest al 0,1% en bicarbonat d'amoni a 50 mM i sonicar en un bany d'aigua. La concentració de proteïna del pellet i del sobrenedant es va mesurar mitjançant l'assaig BCA, les mostres es van reduir amb 5 mM de ditiotreitol (DTT; Sigma), es van alquilar amb 15 mM de iodoacetamida (Sigma) i es van incubar a 37 °C (1:0 50) durant 1 hora amb una relació tripsinització: tripsina: substrat). RapiGest es va lisar mitjançant l'addició de 200 mM de HCl, seguit d'incubació a 37 °C durant 45 minuts i centrifugació a 14.000 rpm durant 10 minuts a 4 °C per eliminar les restes. Les mostres es van rentar mitjançant extracció en fase sòlida de mode dual (cartutxos Oasis MCX, Waters) i es van resuspendre en àcid fòrmic al 0,1% per a una concentració final de proteïna de 0,33 µg µl-1. Els proteomes MAG sense marcar es van analitzar de manera similar a partir de mascles verges. Es van analitzar dues rèpliques analítiques per a cada mostra. A continuació, Es va analitzar 1 µg de cadascun utilitzant una columna de sílice fosa de 25 cm i 75 μm amb una trampa de frita Kasil1 (PQ) de sílice fosa de 4 cm empaquetada amb resina de fase inversa Jupiter C12 (Phenomenex) i cromatografia líquida de 180 minuts. Digests de mostres: l'MS/MS es va executar en un espectròmetre de masses Q-Exactive HF (Thermo Fisher) amb un sistema nanoACQUITY UPLC (Waters). Les dades d'adquisició relacionades amb les dades generades per a cada execució es van convertir al format mzML mitjançant Proteowizard (versió 3.0.20287) i mitjançant Comet31 (versió 3.2) contra la base de dades FASTA que conté seqüències de proteïnes d'Anopheles gambiae (VectorBase versió 54), Anopheles coluzzi. Es va realitzar una cerca a Mali-NIH (VectorBase versió 54), Saccharomyces cerevisiae (Uniprot, març de 2021), A. gambiae RNA-seq i traduccions de tres marcs de contaminants humans coneguts. Les FDR coincidents amb el mapa de pèptids es van determinar mitjançant Percolator32 (versió 3.05) amb un llindar de 0,01, i els pèptids es van assemblar en identificacions de proteïnes mitjançant parsimònia de proteïnes a Limelight33 (versió 2.2.0). Proteïna relativa L'abundància es va estimar utilitzant el factor d'abundància espectral normalitzat (NSAF) calculat per a cada proteïna en cada execució, tal com s'ha descrit anteriorment. El NSAF relatiu a cada proteïna es va promediar entre mostres de dues rèpliques biològiques diferents. El marcatge amb 15N va emmascarar amb èxit el proteoma femení, tot i que es va poder detectar una petita quantitat de proteïna sense marcar a partir de les verges marcades. Vam registrar la detecció de la reducció de la proteïna masculina (espectres 1-5) en mostres crues femenines només en execucions tècniques, on les mostres crues es van executar després de mostres masculines/d'aparellament, com a resultat de la "transportació" per HPLC. Les proteïnes ocasionals que es troben com a "contaminants" de verges marcades es mostren a la Taula Suplementària 1.
Dos pèptids antigènics, QTTDRVAPAPDQQQ (dins de l'isotip PA) i MESDGTTPSGDSEQ (dins de l'isotip PA i PB) a Genscript. Els dos pèptids es van combinar, després es van conjugar amb la proteïna portadora KLH i es van injectar en conills de Nova Zelanda. Els conills van ser sacrificats després de la quarta injecció i la IgG total es va aïllar per purificació per afinitat. La IgG del conill més específic d'EPP es va utilitzar per a una posterior transferència occidental.
Per a les transferències western, es va afegir per separat MAG (n = 10, on n representa el nombre de mostres de mosquits biològicament independents) i LRT femella (n = 30) de mascles verges de 4 dies i femelles verges o aparellades per força (<10 després de l'aparellament), tampó d'extracció de proteïnes (50 mM Tris, pH 8,0; 1% NP-40; 0,25% desoxicolat de sodi; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA; còctel d'inhibidors de proteases 1× (Roche)). Les mostres es van homogeneïtzar immediatament després de la dissecció amb una esfera (esferes de vidre de 2 mm, 2.400 rpm, 90 segons). Les restes insolubles es van eliminar per centrifugació a 20.000 g a 4 °C. Les proteïnes es van quantificar mitjançant assaig de Bradford (Bio-Rad). A continuació, es van afegir 20 µg de proteïna MAG, 40 µg de proteïna LRT i 20 µg de proteïna a granel residual. es van desnaturalitzar i separar mitjançant un 10% de Bis-Tris NuPAGE utilitzant tampó MOPS. Les proteïnes es van transferir a membranes de fluorur de polivinilidè utilitzant el sistema de transferència iBlot2 (Thermo Fisher). Les membranes es van rentar dues vegades en 1× PBS-T (0,1% de Tween-20 en PBS) i després es van bloquejar en tampó de bloqueig Odyssey (Li-Cor) durant 1 hora a 22 °C. Les membranes es van agitar durant la nit a 4 °C amb un anticòs primari policlonal de conill anti-EPP personalitzat (1:700 en tampó de bloqueig) i un anticòs primari monoclonal de rata anti-actina MAC237 (Abeam; 1:4.000). Les membranes es van rentar amb PBS-T i després es van incubar amb anticossos secundaris (ase anti-conill 800CW i cabra anti-rata 680LT (Li-Cor), tots dos 1:20.000) en tampó de bloqueig que contenia 0,01% de SDS i 0,2% de Tween-20 durant 1 hora a 22 °C. Les membranes es van rentar amb PBS-T i es van obtenir imatges amb un escàner Odyssey CLx. Les imatges es van recollir i processar a Image Studio (versió 5.2). No es va detectar una banda específica corresponent a la isoforma EPP-RA (82 kDa).
Les regions codificants d'EPP (com a isoforma AGAP002463-RB que conté el domini d'histidina fosfatasa, cerca de domini conservat NCBI 34) i EcK2 (AGAP002181) es van clonar en el plasmidi pET-21a(+) (Novagen Millipore Sigma); Els encebadors es mostren a la Taula de dades ampliades 2. Es van inserir vuit enllaçadors GS4 (en tàndem) abans de l'etiqueta 6xHis C-terminal de la construcció pET-21a(+)-EcK2. Les proteïnes recombinants es van produir mitjançant la reacció de síntesi de proteïnes d'E. coli sense cèl·lules NEBExpress (New England BioLabs). Les proteïnes recombinants es van purificar mitjançant columnes de centrifugació NEBExpress Ni (New England BioLabs). La proteïna de control de la dihidrofolat reductasa (DHFR) es va produir mitjançant una plantilla d'ADN del kit de síntesi de proteïnes d'E. coli sense cèl·lules NEBExpress. Les proteïnes es van emmagatzemar en glicerol al 50% en PBS a -20 °C durant un màxim de 3 mesos.
L'activitat fosfatasa de l'EPP i dels extractes de teixits es va mesurar utilitzant fosfat de 4-nitrofenil (pNPP; Sigma-Aldrich). El tampó de reacció contenia 25 mM de Tris, 50 mM d'àcid acètic, 25 mM de Bis-Tris, 150 mM de NaCl, 0,1 mM d'EDTA i 1 mM de DTT. El teixit es va homogeneïtzar en tampó de reacció i les restes cel·lulars es van eliminar per centrifugació. Inicieu la reacció afegint enzim o extracte de teixit al tampó de reacció que conté 2,5 mg ml-1 de pNPP. La mescla de reacció es va incubar a temperatura ambient a les fosques i la quantitat de pNP convertida a partir de pNPP es va quantificar mesurant l'absorbància a 405 nm en diversos moments.
Per a l'activitat EcK in vitro, la proteïna es va incubar amb 0,2 mg de 20E o 3D20E en 200 µl de tampó (pH 7,5) que contenia 10 mM HEPES-NaOH, 0,1% BSA, 2 mM ATP i 10 mM MgCl2 durant 2 h a 27 °C. La reacció es va aturar afegint 800 µl de metanol, després es va refredar a -20 °C durant 1 hora i després es va centrifugar a 20.000 g durant 10 minuts a 4 °C. El sobrenedant es va analitzar mitjançant HPLC-MS/MS. Per inactivar per calor les proteïnes utilitzades al grup de control, les proteïnes es van incubar en glicerol al 50% en PBS durant 20 min a 95 °C.
Per a l'activitat EPP in vitro, la proteïna es va incubar amb 3D20E22P (equivalent a la quantitat trobada en 18 parells de MAG, purificats per HPLC-MS/MS) en 100 µl de tampó (pH 7,5) que contenia 25 mM de Tris, 50 mM d'àcid acètic, 25 mM de Bis-Tris, 150 mM de NaCl, 0,1 mM d'EDTA i 1 mM de DTT durant 3 hores a 27 °C. La reacció es va aturar afegint 400 µl de metanol i es va refredar a -20 °C durant 1 hora, després es va centrifugar a 20.000 g durant 10 minuts a 4 °C. El sobrenedant es va analitzar per HPLC-MS/MS.
Els fragments de PCR per a EPP (362 pb), EcK1 (AGAP004574, 365 pb) i EcK2 (556 pb) es van amplificar a partir de cDNA preparat a partir de cadàvers de mosquits sense cap de sexe mixt. El fragment de PCR del control d'eGFP (495 pb) es va amplificar a partir del pCR2.1-eGFP descrit anteriorment; Els encebadors de PCR es mostren a la Taula de dades ampliades 2. El fragment de PCR es va inserir entre els promotors T7 invertits del plasmidi pL4440. Les construccions plasmídiques es van recuperar d'E. coli competent NEB 5-α (New England Biolabs) i es van verificar mitjançant seqüenciació d'ADN abans del seu ús (vegeu les dades suplementàries 1 per a la seqüència d'inserció). Els encebadors que coincidien amb el promotor T7 (Taula de dades ampliades 2) es van utilitzar per amplificar l'inserció del plasmidi basat en pL4440. La mida del producte PCR es va confirmar mitjançant electroforesi en gel d'agarosa. L'ARN bicatenari es va transcriure a partir de plantilles de PCR mitjançant el kit de transcripció Megascript T7 (Thermo Fisher) i es va purificar segons les instruccions del fabricant amb les modificacions descrites anteriorment.
Per a la injecció de dsRNA, es van injectar 1.380 ng de dsRNA (dsGFP, dsEcK1, dsEcK2, dsEPP) a una concentració de 10 ng nl-1 al tòrax de mascles o femelles adults (Nanoject III, Drummond) en el termini d'1 dia després de l'eclosió. Els nivells d'inhibició gènica es van determinar en almenys tres rèpliques biològiques mitjançant extracció d'ARN, síntesi de cDNA i RT-qPCR. Per a la injecció d'ecdisona, es van injectar femelles verges de 4 dies o verges de 6 dies alimentades amb sang 0,13, 0,21 o 0,63 µg de 20E o 3D20E (Nanoject III, Drummond) a concentracions d'1,3, 2,1, respectivament, depenent del disseny experimental o 6,3 ng nl-1. Injectar 100 nl d'etanol al 10% (vol/vol) en aigua; 100 nl de 3D20E22P en etanol al 10% (equivalent al 75% de la quantitat trobada en un parell de MAG). Els mosquits van ser assignats aleatòriament al grup d'injecció.
Per als assaigs de desova, es van alimentar femelles de 3 dies ad libitum amb sang humana. Es van retirar els mosquits parcialment alimentats o no alimentats. Depenent del tractament, les femelles es van col·locar en tasses de desova separades durant quatre nits almenys 48 hores després de l'àpat de sang. Els ous es van comptar sota un estereoscopi (Stemi 508, Zeiss); per a les femelles aparellades, els ous que van eclosionar en larves es van considerar fèrtils.
Per a les proves d'aparellament, es va permetre que les femelles estiguessin almenys 2 dies depenent del tractament per desenvolupar resistència a l'aparellament, i posteriorment es van introduir mascles de tipus salvatge de la mateixa edat a la mateixa gàbia. Dues nits més tard, es van disseccionar les vesícules fecundades de les femelles i es va alliberar ADN genòmic per congelació-descongelació i sonicació en un tampó que contenia 10 mM de Tris-HCl, 1 mM d'EDTA i 25 mM de NaCl (pH 8,2). Les mostres es van incubar amb proteinasa K (0,86 µg µl-1) durant 15 minuts a 55 °C, seguit de 10 minuts a 95 °C. Les preparacions d'ADN genòmic cru es van diluir 10 vegades i es van sotmetre a detecció per qPCR de seqüències del cromosoma Y; els encebadors es mostren a la Taula de dades ampliades 2. L'absència de la seqüència del cromosoma Y indica que no hi ha aparellament.
Per als assaigs de reaparellament, es van examinar les femelles aparellades forçadament per detectar la presència de taps d'aparellament per confirmar l'estat d'aparellament i es van deixar 2 dies perquè desenvolupessin resistència a l'aparellament en absència de mascles, tal com s'ha descrit anteriorment 36. Els mascles que portaven espermatozoides transgènics DsRed es van introduir a les gàbies de femelles. Dues nits més tard, es van disseccionar les vesícules fertilitzants de les femelles i es va preparar ADN genòmic tal com s'ha descrit anteriorment i es va sotmetre a detecció per qPCR del transgèn DsRed; els encebadors es mostren a la Taula de dades ampliades 2. L'absència del transgèn DsRed va indicar que no es va produir cap reaparellament.
El 3D20E es va sintetitzar tal com s'ha descrit anteriorment 37. Breument, es van dissoldre 10 mg de 20E (Sigma-Aldrich) en 10 ml d'aigua, seguit de l'addició de 30 mg de negre de platí (en forma de pols, Sigma-Aldrich). Es va bombollejar contínuament un corrent suau d'O2 a la mescla de reacció, que es va agitar a temperatura ambient. Després de 6 hores, es van afegir 30 mL de metanol per aturar la reacció. La mescla es va centrifugar per eliminar les partícules de catalitzador. El sobrenedant es va evaporar fins a sequedat al buit a temperatura ambient. El producte de reacció assecat es va dissoldre en etanol al 10% i metanol per a la injecció per a l'anàlisi HPLC-MS/MS. La taxa de conversió (de 20E a 3D20E) va ser aproximadament del 97% (Fig. 4b), i l'espectre MS del 3D20E sintetitzat coincidia amb el que es va trobar en femelles aparellades (Fig. 4c).
La llegenda conté detalls específics de les proves estadístiques realitzades. Es va utilitzar GraphPad (versió 9.0) per realitzar la prova exacta de Fisher, la prova de Mantel-Cox i la prova t de Student. Les proves de Cochran-Mantel-Haenszel es van realitzar mitjançant un script R personalitzat (disponible a https://github.com/duopeng/mantelhaen.test). La distribució de dades es va provar per a la normalitat mitjançant la prova de Shapiro-Wilk amb un llindar de significació de 0,05. Quan les dades no van superar la prova de normalitat, es va realitzar la prova de Mann-Whitney. Les dades de supervivència es van analitzar mitjançant la prova de Mantel-Cox. Es va utilitzar el paquet DESeq2 (versió 1.28.1) per realitzar l'anàlisi d'expressió diferencial a nivell de gen RNA-seq. La barra horitzontal del gràfic representa la mediana. Es va utilitzar un valor de significació de P = 0,05 com a llindar per a totes les proves.
Per obtenir més informació sobre el disseny de l'estudi, consulteu el resum de Nature Research Report enllaçat a aquest article.
Les dades proteòmiques de MS es van dipositar al ProteomeXchange Consortium (http://proteomecentral.proteomexchange.org) a través del PRIDE Partner Repository (https://www.ebi.ac.uk/pride/) amb l'identificador de conjunt de dades PXD032157.
El conjunt de dades de RNA-seq es troba dipositat a la Gene Expression Comprehensive Library (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) amb el registre en sèrie GSE198665.
Es poden obtenir conjunts de dades addicionals generats i/o analitzats durant l'estudi actual dels autors corresponents si es sol·licita raonablement. Aquest article proporciona les dades originals.
De Loof, A. Ecdisteroides: esteroides sexuals d'insectes descuidats? Masculí: Black Box. Insect Science. 13, 325–338 (2006).
Redfern, CPF 20-hidroxiecdisona i desenvolupament ovàric en Anopheles stephens. J. Insect Physiology. 28, 97–109 (1982).
Data de publicació: 08 de juliol de 2022