Javascript està actualment desactivat al vostre navegador. Algunes funcions d'aquest lloc web no funcionaran quan Javascript estigui desactivat.
Registra't amb les teves dades específiques i el medicament específic que t'interessa i nosaltres compararem la informació que ens proporcionis amb els articles de la nostra extensa base de dades i t'enviarem una còpia en PDF immediatament per correu electrònic.
Els grànuls de Ban-Lan-Gen atenuen la colitis crònica recurrent induïda per sulfat de sodi de dextran en ratolins mitjançant la modulació de la microbiota intestinal i la restauració de la producció intestinal de SCFA Derived-GLP-1
Jiao Peng, 1-3, * Li Xi, 4, * Zheng Lin, 3, 5 Duan Lifang, 1 Gao Zhengxian, 2, 5 Diehu, 1 Li Jie, 6 Li Xiaofeng, 6 Shen Xiangchun, 5 Xiao Haitao21 Universitat de Pequín, Hospital de Shenzhen, Departament de Farmàcia, Shenzhen, República Popular de la Xina; 2 Centre de Ciències de la Salut de la Universitat de Shenzhen, Facultat de Farmàcia, Shenzhen, República Popular de la Xina; 3 Universitat Mèdica de Guizhou, Centre de Recerca en Tecnologia d'Enginyeria de Medicina Ètnica i Desenvolupament i Aplicació de la Medicina Tradicional Xinesa, Ministeri d'Educació, Laboratori Clau Provincial de Farmàcia de Guizhou, Universitat Mèdica de Guizhou, Guiyang, República Popular de la Xina; 4 Departament de Gastroenterologia, Hospital de Shenzhen, Universitat de Pequín, Shenzhen, República Popular de la Xina; 5 Facultat de Farmàcia, Universitat Mèdica de Guizhou, Laboratori Clau Estatal de Funció i Aplicació de Plantes Medicinals, Guiyang; 6 Departament de Medicina de Laboratori, Hospital Universitari de Pequín de Shenzhen, Shenzhen, Xina [email protected] Shen Xiangchun, Facultat de Farmàcia, Universitat Mèdica de Guizhou, Guizhou, República Popular de la Xina, 550004, Correu electrònic [email protected] Objectiu: La teràpia basada en GLP-1 és una nova opció de tractament per a la malaltia inflamatòria intestinal. Els grànuls de Ban-Lan-Gen (BLG) són una formulació antiviral coneguda de la medicina tradicional xinesa que presenta una potencial activitat antiinflamatòria en el tractament de diverses afeccions inflamatòries. Tanmateix, el seu efecte antiinflamatori sobre la colitis i el seu mecanisme d'acció encara no estan clars. MÈTODES: Establir la colitis crònica recurrent induïda per sulfat de dextran sòdic (DSS) en ratolins. Es van realitzar índexs d'activitat de la malaltia, marcadors histològics de lesió i nivells de citocines proinflamatòries per avaluar l'efecte protector de BLG. Els efectes de BLG sobre la microbiota intestinal i l'intestí es van caracteritzar pels nivells sèrics de GLP-1 i l'expressió colònica de Gcg, GPR41 i GRP43, la composició de la microbiota intestinal, els nivells de SCFA fecals i l'alliberament de GLP-1 de l'intestí primari. Producció de GLP-1 derivada de SCFA en cèl·lules epitelials del còlon de ratolí. Resultats: El tractament amb BLG va reduir significativament la pèrdua de pes corporal, el DAI, l'escurçament del còlon, el dany al teixit del còlon i els nivells de citocines proinflamatòries de TNF-α, IL-1β i IL-6 en el teixit del còlon. A més, el tractament amb BLG pot restaurar significativament l'expressió colònica de Gcg, GPR41 i GRP43 i els nivells sèrics de GLP-1 en ratolins amb colitis, i augmentant els bacteris productors de SCFA com ara Akkermansia i Prevotellaceae_UCG-001, i reduint l'abundància de bacteris com ara Eubacterium_xylanophilum_group, Ruminococcaceae_UCG-014, Intestinimonas i Oscillibacter. A més, el tractament amb BLG pot augmentar significativament el nivell de SCFA a les femtes dels ratolins amb colitis. Al mateix temps, els experiments in vitro també van mostrar que l'extracte fecal de ratolins tractats amb BLG pot estimular en gran mesura que les petites cèl·lules epitelials del còlon murines primàries secretin GLP-1. Conclusions: Aquestes troballes suggereixen que el BLG té un efecte anticolitis. El BLG té el potencial de ser desenvolupat com a teràpia, almenys en part modulant la microbiota intestinal i restaurant la producció intestinal de GLP-1 derivat d'AGCC. Fàrmacs prometedors per a la colitis crònica recurrent. Paraules clau: colitis, grànuls de Ban-Lan-Gen, microbiota intestinal, àcids grassos de cadena curta, GLP-1.
La colitis ulcerosa (CU) és una malaltia inflamatòria a llarg termini del còlon i el recte caracteritzada per diarrea recurrent, dolor abdominal, pèrdua de pes i femtes mucopurulentes amb sang.1 Recentment, la prevalència de la CU ha anat augmentant en països anteriorment de baixa incidència, inclosa la Xina, amb la creixent popularitat dels estils de vida occidentals.2 Aquest augment planteja problemes importants per a la salut pública i té greus implicacions per a la capacitat de treball i la qualitat de vida dels pacients. En particular, la patogènesi de la CU continua sent en gran part poc clara, però generalment s'accepta que la genètica, els factors ambientals, la microbiota intestinal i el sistema immunitari contribueixen al desenvolupament de la CU.3 Fins i tot ara, no hi ha cura per a la CU, i l'objectiu del tractament és controlar clínicament els símptomes clínics, induir i mantenir la remissió, promoure la curació de la mucosa i reduir la recurrència. Els tractaments clàssics inclouen aminosalicilats, corticosteroides, immunosupressors i biològics. Tanmateix, aquests fàrmacs no poden aconseguir l'efecte desitjat a causa dels seus diversos efectes secundaris.4 Recentment, molts estudis de casos han demostrat que la medicina tradicional xinesa (MTX) ha demostrat un gran potencial per ajudar per alleujar la CU amb baixa toxicitat, cosa que suggereix que el desenvolupament de noves teràpies de la medicina tradicional xinesa és una estratègia de tractament prometedora per a la CU.5-7
Els grànuls de Banlangen (BLG) són una preparació de la medicina tradicional xinesa feta a partir de l'extracte aquós de l'arrel de Banlangen.8 A més de la seva eficàcia antiviral, el BLG presenta una potencial activitat antiinflamatòria en el tractament de diverses afeccions inflamatòries.9,10 A més, s'han aïllat i identificat glucosinolats (R,S-goitrina, progoitrina, epiprorubina i glucòsid a partir d'extractes aquosos de Radix isatidis) i nucleòsids (hipoxantina, adenosina, uridina i guanosina) i alcaloides d'indi com l'indi i la indirubina.11,12 Estudis previs han documentat bé que els compostos adenosina, uridina i indirubina presenten potents efectes anticolitis en diferents models animals de colitis.13-17 Tanmateix, no s'han dut a terme estudis basats en l'evidència per avaluar l'eficàcia del BLG en la colitis. En el present estudi, vam investigar l'efecte protector del BLG sobre la colitis crònica recurrent induïda per sulfat de dextran sòdic (DSS) en ratolins C57BL/6 i vam trobar que L'administració oral de BLG va atenuar significativament la inflamació crònica recurrent del còlon induïda per DSS en ratolins, els seus mecanismes reguladors s'associen amb la modulació de la microbiota intestinal i la restauració de la producció de pèptid similar al glucagó-1 (GLP-1) derivat de l'intestí.
Els grànuls de BLG (sense sucre, aprovats per NMPA Z11020357; Beijing Tongrentang Technology Development Co., Ltd., Pequín, Xina; número de lot: 20110966) es van comprar a farmàcies. El DSS (pes molecular: 36.000–50.000 Daltons) es va comprar a MP Biologicals (Santa Ana, EUA). La sulfasalazina (SASP) (≥ 98% de puresa), l'hematoxilina i l'eosina es van comprar a Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA). Els kits d'assaig Elisa luminex de TNF-α, IL-1β i IL-6 de ratolí es van comprar a R&D systems (Minneapolis, MN, EUA). L'àcid acètic, l'àcid propiònic i l'àcid butíric es van comprar a Aladdin Industries (Xangai, Xina). L'àcid 2-etilbutíric es va comprar a Merck KGaA (Darmstadt, Alemanya).
Es van comprar ratolins mascles C57BL/6 de 6 a 8 setmanes d'edat (pes corporal 18-22 g) de Beijing Wetahe Laboratory Animal Technology Co., Ltd. (Pequín, Xina) i es van allotjar en un ambient de 22 ± 2 °C amb un cicle de llum/foscor de 12 h. Els ratolins van ser alimentats amb una dieta estàndard de rosegadors amb lliure accés a aigua potable durant una setmana per aclimatar-se al nou ambient. Els ratolins es van dividir aleatòriament en quatre grups: grup de control, grup model DSS, grup tractat amb SASP (200 mg/kg, oral) i grup tractat amb BLG (1 g/kg, oral). Com es mostra a la Figura 1A, segons el nostre estudi anterior, la colitis crònica recurrent experimental es va induir en ratolins mitjançant tres cicles de DSS a l'1,8% durant 5 dies, seguits d'aigua destil·lada durant 7 dies, segons el nostre estudi anterior.18 Els ratolins dels grups tractats amb SASP i BLG van ser tractats amb SASP i BLG, respectivament, cada dia a partir del dia 0. Segons experiments preliminars, la dosi de La BLG es va establir en 1 g/kg. Mentrestant, la dosi de SASP es va establir en 200 mg/kg segons la literatura.4 Els grups de control i del model DSS van rebre el mateix volum d'aigua durant tot l'experiment.
Figura 1 El BLG millora la colitis crònica recurrent induïda per DSS en ratolins. (A) Disseny experimental de colitis crònica recurrent i tractament, (B) canvi de pes corporal, (C) puntuació de l'índex d'activitat de la malaltia (DAI), (D) longitud del còlon, (E) imatge representativa del còlon, (F) tinció de H&E del còlon (augment, ×100) i (G) puntuació histològica. Les dades es presenten com a mitjana ± SEM (n = 6). ##p < 0,01 o ###p < 0,001 vs grup control (Con); *p < 0,05 o **p < 0,01 o ***p < 0,001 vs grup DSS.
El pes corporal, la consistència de les femtes i el sagnat rectal es van registrar diàriament. L'índex d'activitat de la malaltia (DAI) es va determinar combinant les puntuacions de pes corporal, consistència de les femtes i sagnat rectal, tal com s'ha descrit anteriorment.19 Al final de l'experiment, tots els ratolins van ser sacrificats i es va recollir sang, femtes i còlon per a experiments posteriors.
El teixit del còlon es va fixar amb formalina i es va incloure en parafina. Es van fer seccions de 5 micres i es van tenyir amb hematoxilina-eosina (H&E), després es van cegar i es van puntuar tal com s'ha descrit anteriorment.19
L'ARN total del teixit del còlon es va extreure amb el reactiu Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA), seguit d'una extracció d'ADNc amb transcriptasa inversa (TaKaRa, Kusatsu, Shiga, Japó). La PCR quantitativa es va realitzar mitjançant un sistema de PCR en temps real amb SYBR Green Master (Roche, Basilea, Suïssa). Els transcrits del gen diana es van normalitzar a β-actina i les dades es van analitzar mitjançant el mètode 2-ΔΔCT. Les seqüències dels encebadors gènics es mostren a la Taula 1.
L'aïllament i el cultiu primari de cèl·lules epitelials del còlon de ratolí es van dur a terme tal com s'ha descrit anteriorment.20 Breument, els còlons de ratolins de 6-8 setmanes d'edat es van excisar primer després del sacrifici per dislocació cervical, després es van obrir longitudinalment, es van tractar amb solució salina equilibrada de Hanks (HBSS, sense calci ni magnesi) i es van tallar en trossos petits de 0,5-1 mm. Posteriorment, els teixits es van digerir amb 0,4 mg/mL de colagenasa XI (Sigma, Poole, Regne Unit) en medi DMEM lliure i es van centrifugar a 300 xg durant 5 min a temperatura ambient. Resuspendre el pellet en medi DMEM (suplementat amb un 10% de sèrum fetal boví, 100 unitats/mL de penicil·lina i 100 µg/mL d'estreptomicina) a 37 °C i passar-lo a través d'una malla de niló (mida de porus ~250 µm). Es van col·locar alíquotes de cèl·lules epitelials del còlon en plaques amb fons de vidre i es van incubar amb àcid acètic, àcid propiònic, àcid butíric i extractes fecals de ratolí durant... 2 hores a 37 °C, 5% de CO2.
El teixit del còlon es va homogeneïtzar amb PBS i els nivells de citocines IL-6, TNF-α i IL-1β en el teixit del còlon es van detectar mitjançant kits d'assaig ELISA luminex (R&D systems, Minneapolis, MN, EUA). De la mateixa manera, els nivells de GLP-1 en sèrum i medi de cultiu de cèl·lules epitelials del còlon murines primàries es van determinar amb un kit ELISA (Bioswamp, Wuhan, Xina) segons les instruccions del fabricant.
L'ADN total de les femtes es va extreure mitjançant un kit d'extracció d'ADN (Tiangen, Xina). La qualitat i la quantitat d'ADN es van mesurar a les proporcions de 260 nm/280 nm i 260 nm/230 nm, respectivament. Posteriorment, utilitzant cada ADN extret com a plantilla, es van utilitzar els encebadors específics 338F (ACTCCTACGGGAGGCAG) i 806R (GGACTACHVGGGTWTCTAAT) per amplificar les regions V3-V4 del gen 16S rRNA en diferents regions. Els productes de PCR es van purificar mitjançant el kit d'extracció de gel QIAquick (QIAGEN, Alemanya), es van quantificar per PCR en temps real i es van seqüenciar mitjançant la plataforma de seqüenciació IlluminaMiseq PE300 (Illumina Inc., CA, EUA). Per a l'anàlisi bioinformàtica, el processament de dades es va realitzar seguint els protocols descrits anteriorment.21,22 En resum, utilitzeu Cutadapt (V1.9.1) per filtrar els fitxers exprés en brut. Les OTU es van agrupar mitjançant UPARSE. (versió 7.0.1001) amb un tall de similitud del 97%, i es va utilitzar UCHIME per eliminar seqüències quimèriques. L'anàlisi i la classificació de la composició comunitària es van realitzar mitjançant el classificador RDP (http://rdp.cme.msu.edu/) basat en la base de dades de gens d'ARN ribosòmic SILVA.
Els nivells d'àcids grassos de cadena curta (àcid acètic, àcid propiònic i àcid butíric) es van mesurar tal com van descriure anteriorment Tao et al., amb algunes modificacions.23 Breument, primer es van suspendre 100 mg de femta en 0,4 mL d'aigua desionitzada, seguit de 0,1 mL d'àcid sulfúric al 50% i 0,5 mL d'àcid 2-etilbutíric (estàndard intern), després es van homogeneïtzar i es van escalfar a 4 °C. Centrifugar a 12.000 rpm durant 15 minuts a C. El sobrenedant es va extreure amb 0,5 mL d'èter i es va injectar al GC per a la seva anàlisi. Per a l'anàlisi de cromatografia de gasos (GC), les mostres es van analitzar mitjançant un cromatògraf de gasos GC-2010 Plus (Shimadzu, Inc.) equipat amb un detector d'ionització de flama (FID). La separació es va aconseguir mitjançant una columna ZKAT-624, 30 m × 0,53 mm × 0,3 μm (Lanzhou Zhongke Antai Analytical Technology Co., Ltd., Xina). Les dades es van adquirir mitjançant el programari de solucions GC (Shimadzu, Inc.). La proporció de divisió va ser de 10:1, el gas portador va ser nitrogen i el cabal va ser de 6 mL/min. El volum d'injecció va ser d'1 μL. La temperatura de l'injector i del detector va ser de 300 °C. La temperatura del forn es va mantenir a 140 °C durant 13,5 minuts i després es va augmentar a 250 °C a una velocitat de 120 °C/min; la temperatura es va mantenir durant 5 minuts.
Les dades es presenten com a mitjana ± error estàndard de la mitjana (SEM). La significació de les dades es va avaluar mitjançant ANOVA unidireccional seguida de la prova de rang múltiple de Duncan. Es va utilitzar el programari GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, EUA) per a tots els càlculs i es va considerar estadísticament significatiu un valor de p < 0,05.
És ben sabut que la CU és una colitis crònica recurrent amb dolor abdominal intens, diarrea i sagnat. Per tant, es va establir la colitis crònica recurrent induïda per DSS en ratolins per avaluar l'eficàcia anticolitis de BLG (Fig. 1A). En comparació amb el grup de control, els ratolins del grup del model DSS tenien un pes corporal significativament reduït i un DAI més alt, i aquests canvis es van revertir significativament després de 24 dies de tractament amb BLG (Figura 1B i C). L'escurçament del còlon és una característica important de la CU. Com es mostra a les Figures 1D i E, la longitud del còlon dels ratolins que van rebre DSS es va escurçar significativament, però es va alleujar amb el tractament amb BLG. Posteriorment, es va realitzar una anàlisi histopatològica per avaluar la inflamació colònica. Les imatges tenyides amb H&E i les puntuacions patològiques van mostrar que l'administració de DSS va interrompre significativament l'arquitectura colònica i va provocar la destrucció de les criptes, mentre que el tractament amb BLG va reduir significativament la destrucció de les criptes i les puntuacions patològiques (Figura 1F i G). Cal destacar que l'efecte protector de BLG a una dosi d'1 g/kg va ser comparable al de SASP a dosi de 200 mg/kg. En conjunt, aquestes troballes suggereixen que el BLG és eficaç per reduir la gravetat de la colitis crònica recurrent induïda per DSS en ratolins.
El TNF-α, la IL-1β i la IL-6 són marcadors inflamatoris importants de la inflamació del còlon. Com es mostra a la Figura 2A, el DSS va induir un augment significatiu en l'expressió gènica del TNF-α, la IL-1β i la IL-6 al còlon en comparació amb el grup de control. L'administració de BLG pot revertir significativament aquests canvis mediats per DSS. A continuació, vam utilitzar ELISA per determinar els nivells de les citocines inflamatòries TNF-α, IL-1β i IL-6 al teixit del còlon. Els resultats també van mostrar que els nivells colònics de TNF-α, IL-1β i IL-6 van augmentar significativament en els ratolins tractats amb DSS, mentre que el tractament amb BLG va alleujar aquests augments (Figura 2B).
Figura 2 El BLG inhibeix l'expressió gènica i la producció de les citocines proinflamatòries TNF-α, IL-1β i IL-6 al còlon de ratolins tractats amb DSS. (A) Expressió gènica colònica de TNF-α, IL-1β i IL-6; (B) Nivells de proteïna colònica de TNF-α, IL-1β i IL-6. Les dades es presenten com a mitjana ± SEM (n = 4–6). #p < 0,05 o ##p < 0,01 o ###p < 0,001 vs grup control (Con); *p < 0,05 o **p < 0,01 vs grup DSS.
La disbiosi intestinal és crítica en la patogènesi de la CU.24 Per investigar si la BLG modula la microbiota intestinal dels ratolins tractats amb DSS, es va realitzar la seqüenciació de 16S rRNA per analitzar la comunitat bacteriana del contingut intestinal. El diagrama de Venn mostra que els tres grups comparteixen 385 OTU. Al mateix temps, cada grup tenia OTU úniques (Fig. 3A). A més, l'índex Chao1 i l'índex Shannon que es mostren a la Figura 3B i C van mostrar que la diversitat comunitària de la microbiota intestinal es va reduir en els ratolins tractats amb BLG, ja que l'índex Shannon va disminuir significativament en el grup tractat amb BLG. L'anàlisi de components principals (PCA) i l'anàlisi de coordenades principals (PCoA) es van utilitzar per determinar els patrons d'agrupació entre els tres grups i van mostrar que l'estructura comunitària dels ratolins tractats amb DSS estava clarament separada després del tractament amb BLG (Figura 3D i E). Aquestes dades suggereixen que el tractament amb BLG va afectar significativament l'estructura comunitària dels ratolins amb colitis induïda per DSS.
Figura 3 La BLG altera la diversitat de la microbiota intestinal en ratolins amb colitis induïda per DSS. (A) Diagrama de Venn de l'OTU, (B) Índex de Chao1, (C) Índex de riquesa de Shannon, (D) Gràfic de puntuació de l'anàlisi de components principals (PCA) de l'OTU, (E) Figura de puntuació de l'anàlisi de coordenades principals (PCoA) de l'OTU. Les dades es presenten com a mitjana ± SEM (n = 6). **p < 0,01 vs grup DSS.
Per avaluar canvis específics en la microbiota fecal, vam analitzar la composició de la microbiota intestinal a tots els nivells taxonòmics. Com es mostra a la Figura 4A, els principals fílums en tots els grups van ser Firmicutes i Bacteroidetes, seguits de Verrucomicrobia. Les abundàncies relatives de Firmicutes i les ràtios Firmicutes/Bacteroidetes van augmentar significativament a les comunitats microbianes fecals dels ratolins tractats amb DSS en comparació amb els ratolins de control, i aquests canvis es van revertir significativament després del tractament amb BLG. En particular, el tractament amb BLG va augmentar significativament l'abundància relativa de Verrucobacterium a les femtes dels ratolins amb colitis induïda per DSS. A nivell de la llar, les comunitats microbianes fecals estaven ocupades per Lachnospiriaceae, Muribaculaceae, Akkermansiaceae, Ruminococcaceae i Prevotellaceae (Fig. 4B). En comparació amb el grup DSS, l'esgotament de BLG va augmentar l'abundància d'Akkermansiaceae, però va disminuir l'abundància de Lachnospiraceae i Ruminococcaceae. En particular, a nivell de gènere, la fecal... la microbiota estava ocupada pel grup Lachnospira_NK4A136, Akkermansia i Prevotellaceae_UCG-001 (Fig. 4C). Aquesta troballa també va demostrar que el tractament amb BLG va revertir eficaçment el desequilibri de la microbiota en resposta al repte de DSS, caracteritzat per una disminució del grup Eubacterium_xylanophilum, Ruminococcaceae_UCG-014, Intestinimonas i Oscillibacter, i un augment d'Akkermansia i Prevotellaceae_UCG-001.
Figura 4 La BLG altera l'abundància de la microbiota intestinal en ratolins amb colitis induïda per DSS. (A) Abundància de microbiota intestinal a nivell de fílum; (B) Abundància de microbiota intestinal a nivell de família; (C) Abundància de microbiota intestinal a nivell de gènere. Les dades es presenten com a mitjana ± SEM (n = 6). #p < 0,05 o ###p < 0,001 vs grup control (Con); *p < 0,05 o **p < 0,01 o ***p < 0,001 vs grup DSS.
Considerant que els àcids grassos de cadena curta (AGCC) són els principals metabòlits d'Akkermansia i Prevotellaceae_UCG-001, mentre que l'acetat, el propionat i el butirat són els AGCC més abundants a la llum intestinal,25-27 encara estem en el nostre estudi. Com es mostra a la Figura 5, les concentracions fecals d'acetat, propionat i butirat es van reduir significativament en el grup tractat amb DSS, mentre que el tractament amb BLG va poder suprimir en gran mesura aquesta reducció.
Figura 5. El BLG augmenta els nivells d'AGCC a la femta de ratolins amb colitis induïda per DSS. (A) Contingut d'àcid acètic a la femta; (B) contingut d'àcid propiònic a la femta; (C) contingut d'àcid butíric a la femta. Les dades es presenten com a mitjana ± SEM (n = 6). #p < 0,05 o ##p < 0,01 vs grup control (Con); *p < 0,05 o **p < 0,01 vs grup DSS.
A més, vam calcular el coeficient de correlació de Pearson entre els AGCC diferencials a nivell de gènere i la microbiota fecal. Com es mostra a la Figura 6, Akkermansia es va correlacionar positivament amb la producció d'àcid propiònic (Pearson = 0,4866) i àcid butíric (Pearson = 0,6192). En canvi, tant Enteromonas com Oscillobacter es van associar negativament amb la producció d'acetat, amb coeficients de Pearson de 0,4709 i 0,5104, respectivament. De la mateixa manera, Ruminococcaceae_UCG-014 es va correlacionar negativament amb la producció d'àcid propiònic (Pearson = 0,4508) i àcid butíric (Pearson = 0,5842), respectivament.
Figura 6 Anàlisi de correlació de Pearson entre AGCC diferencials i microbis del còlon. (A) Enteromonas amb àcid acètic; (B) Bacil de concussió amb àcid acètic; (C) Akkermansia vs àcid propiònic; (D) Ruminococcus_UCG-014 amb àcid propiònic; (E) Akkermansia amb àcid butíric; (F) Ruminococcus_UCG-014 amb àcid butíric.
El pèptid similar al glucagó-1 (GLP-1) és un producte postraduccional específic del tipus cel·lular del proglucagó (Gcg) amb propietats antiinflamatòries.28 Com es mostra a la Figura 7, el DSS va induir una disminució significativa en l'expressió de l'ARNm de Gcg. El tractament amb còlon i BLG va poder revertir significativament la reducció de Gcg induïda per DSS en comparació amb el grup de control (Fig. 7A). Al mateix temps, el nivell de GLP-1 al sèrum es va reduir significativament en el grup tractat amb DSS, i el tractament amb BLG va poder prevenir en gran mesura aquesta reducció (Fig. 7B). Com que els àcids grassos de cadena curta poden estimular la secreció de GLP-1 a través de l'activació del receptor 43 acoblat a proteïna G (GRP43) i del receptor 41 acoblat a proteïna G (GRP41), també vam examinar GPR41 i GRP43 al còlon de ratolins amb colitis i vam trobar que l'expressió de l'ARNm colònic de GRP43 i GPR41 va disminuir significativament després del repte amb DSS, i el tractament amb BLG va poder rescatar eficaçment aquestes disminucions (Figura 7C i D).
Figura 7 El BLG augmenta els nivells sèrics de GLP-1 i l'expressió d'ARNm de Gcg, GPR41 i GRP43 al còlon en ratolins tractats amb DSS. (A) Expressió d'ARNm de Gcg al teixit del còlon; (B) Nivell de GLP-1 al sèrum; (C) Expressió d'ARNm de GPR41 al teixit del còlon; (D) Expressió d'ARNm de GPR43 al teixit del còlon. Les dades es presenten com a mitjana ± SEM (n = 5-6). #p < 0,05 o ##p < 0,01 vs grup control (Con); *p < 0,05 vs grup DSS.
Com que el tractament amb BLG podria augmentar els nivells sèrics de GLP-1, l'expressió d'ARNm de Gcg al còlon i els nivells de SCFA fecals en ratolins tractats amb DSS, vam examinar més a fons l'acetat, el propionat i el butirat, així com els ratolins de control (F-Con), colitis DSS (F-Con) -DSS) i colitis tractats amb BLG (F-BLG), sobre l'alliberament de GLP-1 de cèl·lules epitelials del còlon primàries murines. Com es mostra a la Figura 8A, les cèl·lules epitelials del còlon primàries de ratolí tractades amb 2 mM d'àcid acètic, àcid propiònic i àcid butíric, respectivament, van estimular significativament l'alliberament de GLP-1, d'acord amb estudis anteriors.29,30 De la mateixa manera, tots els F-Con, F-DSS i F-BLG (equivalents a 0,25 g de femta) van estimular en gran mesura l'alliberament de GLP-1 de cèl·lules epitelials del còlon primàries murines. Cal destacar que la quantitat de GLP-1 alliberada per les cèl·lules epitelials del còlon primàries de ratolí tractades amb F-DSS va ser molt inferior a la de les cèl·lules epitelials del còlon primàries tractades amb F-Con i F-BLG. cèl·lules epitelials del còlon de ratolí (Figura 8B). Aquestes dades suggereixen que el tractament amb BLG va restaurar significativament la producció intestinal de GLP-1 derivada de SCFA.
Figura 8 L'AGCC derivat de BLG estimula l'alliberament de GLP-1 de cèl·lules epitelials del còlon murines primàries. (A) L'àcid acètic, l'àcid propiònic i l'àcid butíric van estimular l'alliberament de GLP-1 de cèl·lules epitelials del còlon murines primàries; (B) els extractes fecals F-Con, F-DSS i F-BLG van estimular cèl·lules epitelials del còlon murines primàries. Quantitat de GLP-1 alliberat. Es van col·locar alíquotes de cèl·lules epitelials del còlon en plaques de Petri amb fons de vidre i es van tractar amb 2 mM d'àcid acètic, àcid propiònic, àcid butíric i extractes fecals F-Con, F-DSS i F-BLG (equivalent a 0,25 g de femta), respectivament. 2 hores a 37 °C, 5% de CO2, respectivament. La quantitat de GLP-1 alliberada de cèl·lules epitelials del còlon murines primàries es va detectar mitjançant ELISA. Les dades es presenten com a mitjana ± SEM (n = 3). #p < 0,05 o ##p < 0,01 vs. blanc o F-Con; *p < 0,05 vs. F-DSS.
Abreviatures: As, àcid acètic; Pro, àcid propiònic; tanmateix, àcid butíric; F-Con, extracte fecal de ratolins de control; F-DSS, extracte fecal de ratolins amb colitis; F-BLG, de còlon tractat amb BLG. Extractes fecals de ratolins inflamatoris.
Catalogada per l'Organització Mundial de la Salut com a malaltia refractària, la CU s'està convertint en un perill global; Tanmateix, els mètodes eficaços per predir, prevenir i tractar la malaltia encara són limitats. Per tant, hi ha una necessitat urgent d'explorar i desenvolupar noves estratègies terapèutiques segures i efectives per a la CU. Les preparacions de la medicina tradicional xinesa són una opció prometedora perquè s'ha demostrat que moltes preparacions de la medicina tradicional xinesa són efectives en el tractament de la CU a la població xinesa al llarg dels segles, i totes són orgàniques biològiques i materials naturals que són majoritàriament inofensius per als humans i els animals. 31,32 Aquest estudi tenia com a objectiu buscar una preparació de la medicina tradicional xinesa segura i eficaç per al tractament de la CU i explorar el seu mecanisme d'acció. El BLG és una fórmula d'herbes xineses ben coneguda que s'utilitza per tractar la grip. 8,33 El treball al nostre laboratori i a altres ha demostrat que l'indi, un producte de la medicina tradicional xinesa processat a partir de la mateixa matèria primera que el BLG, presenta una eficàcia significativa en el tractament de la CU en humans i animals. 4,34 Tanmateix, els efectes anticolitis del BLG i els seus efectes El mecanisme no està clar. En l'estudi actual, els nostres resultats demostren que el BLG atenua eficaçment la inflamació colònica induïda per DSS, que s'associa amb la modulació de la microbiota intestinal i restauració de la producció de GLP-1 derivada de l'intestí.
És ben sabut que la CU es caracteritza per períodes recurrents amb característiques clíniques típiques, com ara pèrdua de pes, diarrea, sagnat rectal i danys extensos a la mucosa del còlon.35 Així, la colitis crònica recurrent es va administrar mitjançant tres cicles de DSS a l'1,8% durant cinc dies, seguits de set dies d'aigua potable. Com es mostra a la Figura 1B, la pèrdua de pes fluctuant i les puntuacions DAI van indicar una inducció reeixida de colitis crònica recurrent. Els ratolins del grup tractat amb BLG van mostrar una recuperació ascendent a partir del dia 8, que va ser significativament diferent del dia 24. També es van observar els mateixos canvis en la puntuació DAI, cosa que suggereix una millora en la millora clínica de la colitis. Pel que fa a la lesió del còlon i l'estat inflamatori, la longitud del còlon, el dany al teixit del còlon i l'expressió gènica i la producció de les citocines proinflamatòries TNF-α, IL-1β i IL-6 en el teixit del còlon també van millorar molt després del tractament amb BLG. En conjunt, aquests resultats demostren clarament que BLG és eficaç en el tractament de la colitis crònica recurrent en ratolins.
Com exerceix el BLG els seus efectes farmacològics? Nombrosos estudis previs han demostrat que la microbiota intestinal juga un paper clau en la patogènesi de la CU, i les teràpies basades en el microbioma i dirigides al microbioma han sorgit com una estratègia molt atractiva per al tractament de la CU. En el present estudi, vam demostrar que el tractament amb BLG va provocar canvis significatius en la composició de la microbiota intestinal, cosa que suggereix que l'efecte protector del BLG contra la colitis induïda per DSS està relacionat amb la modulació de la microbiota intestinal. Aquesta observació és coherent amb la idea que la reprogramació de l'homeòstasi de la microbiota intestinal és un enfocament important per comprendre l'eficàcia de les preparacions de la medicina tradicional china (MTC). 36,37 Cal destacar que l'Akkermansia és un bacteri gramnegatiu i estrictament anaeròbic que viu a la capa de moc de l'intestí, que degrada les mucines, produeix àcid propiònic, estimula la diferenciació de les cèl·lules caliciformes i manté la funció de la mucosa de la integritat de la barrera. 26 Múltiples dades clíniques i animals suggereixen que l'Akkermansia està altament associada amb una mucosa sana, 38 i l'administració oral d'Akkermansia spp. pot millorar significativament la inflamació de la mucosa.39 Les nostres dades actuals suggereixen que l'abundància relativa d'Akkermansia augmenta significativament després del tractament amb BLG. A més, Prevotellaceae_UCG-001 és un bacteri productor de SCFA.27 Múltiples estudis van mostrar que Prevotellaceae_UCG-001 es va trobar en baixa abundància relativa a les femtes d'animals amb colitis.40,41 Les nostres dades actuals també mostren que el tractament amb BLG pot augmentar significativament l'abundància relativa de Prevotellaceae_UCG-001 al còlon de ratolins tractats amb DSS. En canvi, Oscillibacter és un bacteri mesòfil i estrictament anaeròbic.42 va informar que l'abundància relativa d'Oscillibacter va augmentar significativament en ratolins amb UC i es va correlacionar positivament amb els nivells d'IL-6 i IL-1β i les puntuacions patològiques.43,44 En particular, el tractament amb BLG va reduir significativament l'abundància relativa d'Oscillibacter a les femtes de ratolins tractats amb DSS. En particular, aquests bacteris alterats amb BLG van ser els bacteris que més SCFA productors van ser. Nombrosos estudis anteriors han demostrat el potencial beneficiós efectes dels AGCC sobre la inflamació del còlon i la protecció de la integritat de l'epiteli intestinal.45,46 Les nostres dades actuals també van observar que les concentracions d'acetat, propionat i butirat d'AGCC en femta tractada amb DSS van augmentar considerablement en ratolins tractats amb BLG. En conjunt, aquestes troballes demostren clarament que el tractament amb BLG pot millorar eficaçment els bacteris productors d'AGCC induïts per DSS en ratolins amb colitis crònica recurrent.
El GLP-1 és una incretina produïda principalment a l'ili i al còlon i juga un paper important en el retard del buidatge gàstric i la reducció de la glucosa en sang postprandial.47 L'evidència suggereix que la dipeptidil peptidasa (DPP)-4, un agonista del receptor GLP-1 i una nanomedicina de GLP-1 pot alleujar eficaçment la inflamació intestinal en ratolins.48-51 Com es va informar en estudis anteriors, les concentracions elevades de SCFA es van associar amb els nivells plasmàtics de GLP-1 en humans i ratolins.52 Les nostres dades actuals mostren que després del tractament amb BLG, els nivells sèrics de GLP-1 i l'expressió d'ARNm de Gcg van augmentar significativament. De la mateixa manera, la secreció de GLP-1 va augmentar significativament en cultius colònics després de l'estimulació amb extractes fecals de ratolins amb colitis tractats amb BLG en comparació amb l'estimulació amb extractes fecals de ratolins amb colitis tractats amb DSS. Com afecten els SCFA l'alliberament de GLP-1? Gwen Tolhurst et al. va informar que els SCFA poden estimular la secreció de GLP-1 a través de GRP43 i GPR41.29 Les nostres dades actuals també mostren que el tractament amb BLG augmenta significativament l'expressió d'ARNm de GRP43 i GPR41 al còlon de ratolins tractats amb DSS. Aquestes dades suggereixen que el tractament amb BLG pot restaurar la producció de GLP-1 promoguda per SCFA activant GRP43 i GPR41.
El BLG és un medicament de venda lliure (OTC) a llarg termini a la Xina. La dosi màxima tolerada de BLG en ratolins Kunming és de 80 g/kg, i no s'ha observat cap toxicitat aguda.53 Actualment, la dosi recomanada de BLG (sense sucre) en humans és de 9-15 g/dia (3 vegades al dia). El nostre estudi va demostrar que el BLG a 1 g/kg millorava la colitis crònica recurrent induïda per DSS en ratolins. Aquesta dosi s'acosta a la dosi de BLG utilitzada clínicament. El nostre estudi també va trobar que el seu mecanisme d'acció està mediat, almenys en part, per alteracions en la microbiota intestinal, específicament bacteris productors de SCFA, com ara Akkermansia i Prevotellaceae_UCG-001, per restaurar la producció de GLP-1 derivada de l'intestí. Aquestes troballes suggereixen que el BLG mereix una major consideració com a possible agent terapèutic per al tractament clínic de la colitis. Tanmateix, el mecanisme exacte pel qual modula la microbiota intestinal encara s'ha de confirmar mitjançant ratolins amb deficiència de microbiota i trasplantament de bacteris fecals.
As, àcid acètic; but, àcid butíric; BLG, pandan; DSS, sulfat de sodi de dextran; DAI, índex d'activitat de la malaltia; DPP, dipeptidil peptidasa; FID, detector d'ionització de flama; F-Con, control Extractes fecals de ratolins; F-DSS, extractes fecals de ratolins amb colitis DSS; F-BLG, extractes fecals de ratolins amb colitis tractats amb BLG; GLP-1, pèptid similar al glucagó-1; Gcg, glucagó; cromatografia de gasos, cromatografia de gasos; GRP43, receptor 43 acoblat a la proteïna G; GRP41, receptor 41 acoblat a la proteïna G; H&E, hematoxilina-eosina; HBSS, solució salina equilibrada de Hanks; OTC, OTC; PCA, anàlisi de components principals; PCoA, anàlisi de coordenades principals; Pro, àcid propiònic; SASP, sulfasalazina; SCFA, àcids grassos de cadena curta; medicina xinesa, medicina tradicional xinesa; CU, colitis ulcerosa.
Tots els protocols experimentals van ser aprovats pel Comitè d'Ètica Animal del Centre Mèdic de la Universitat de Ciència i Tecnologia de la Universitat de Pequín Shenzhen-Hong Kong (Shenzhen, Xina) d'acord amb les Directrius Institucionals i el Reglament Animal (número d'ètica A2020157).
Tots els autors van fer contribucions significatives a la concepció i el disseny, l'adquisició de dades o l'anàlisi i interpretació de dades; van participar en la redacció de l'article o en la revisió crítica de contingut intel·lectual important; van acordar enviar el manuscrit a la revista actual; van aprovar finalment la versió per a la seva publicació; van ser responsables de tots els aspectes del treball.
Aquest treball ha estat finançat per la Fundació Nacional de Ciències Naturals de la Xina (81560676 i 81660479), el projecte de primera classe de la Universitat de Shenzhen (86000000210), el Fons del Comitè d'Innovació en Ciència i Tecnologia de Shenzhen (JCYJ20210324093810026), el Fons de Recerca en Ciència i Tecnologia Mèdica de la Província de Guangdong (A2020157 i A2020272), la Farmàcia de la Universitat Mèdica de Guizhou de la província de Guizhou, finançada per Key Laboratory (YWZJ2020-01) i l'Hospital Universitari de Shenzhen de la Universitat de Pequín (JCYJ2018009).
1. Tang B, Zhu J, Zhang B, et al. Potencial terapèutic del triptòlid com a agent antiinflamatori en la colitis experimental induïda per sulfat sòdic de dextran en ratolins. pre-immune. 2020; 11: 592084. doi: 10.3389 / fimmu. 2020.592084
2. Kaplan GG. La càrrega global de la malaltia inflamatòria intestinal: del 2015 al 2025. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 2015; 12: 720–727. doi: 10.1038/nrgastro. 2015.150
3. Peng J, Zheng TT, Li Xue, et al. Alcaloides derivats de plantes: modificadors prometedors de la malaltia en la malaltia inflamatòria intestinal. Prepharmacology. 2019; 10: 351. doi: 10.3389 / fphar. 2019.00351
4. Xiao Haiteng, Peng Jie, Wen B, et al. Indigo Naturalis inhibeix l'estrès oxidatiu colònic i les respostes Th1/Th17 en la colitis induïda per DSS en ratolins. Oxid Med Cell Longev. 2019;2019:9480945. doi: 10.1155/2019/9480945
5. Chen M, Ding Y, Tong Z. Eficàcia i seguretat de la medicina herbal xinesa Sophora flavescens (Sophora flavescens) en el tractament de la colitis ulcerosa: evidència clínica i possibles mecanismes. Prepharmacology. 2020; 11: 603476. doi: 10.3389 / fphar. 2020.603476
6. Cao Fang, Liu Jie, Sha Benxing, Pan HF. Productes naturals: fàrmacs experimentalment eficaços per al tractament de la malaltia inflamatòria intestinal. Curr Pharmaceuticals. 2019; 25: 4893–4913. doi: 10.2174/1381612825666191216154224
7. Zhang C, Jiang M, Lu A. Reflexions sobre el tractament adjuvant de la colitis ulcerosa amb medicina tradicional xinesa. Clinical Rev Allergy Immunization. 2013; 44: 274–283. doi: 10.1007/s12016-012-8328-9
8. Li Zhongteng, Li Li, Chen TT, et al. Eficàcia i seguretat dels grànuls de Banlangen en el tractament de la grip estacional: un protocol d'estudi per a un assaig controlat aleatoritzat. trial. 2015; 16: 126. doi: 10.1186 / s13063-015-0645-x