La classificació de proteïnes a la via secretora és essencial per mantenir la compartimentació i l'homeòstasi cel·lular. A més de la classificació mediada per closques, el paper dels lípids en la classificació de cinesina en el procés de transport secretor és una qüestió bàsica de llarga data que encara no s'ha respost. Aquí, realitzem imatges 3D simultànies multicolor d'alta resolució en temps real per demostrar in vivo que les proteïnes immobilitzades amb glicosilfosfatidilinositol recentment sintetitzades amb grups lipídics de ceramida molt llargs s'agrupen i es classifiquen en un lloc de sortida neta d'endoplasmes especialitzat, que és diferent del que utilitzen les proteïnes transmembrana. A més, mostrem que la longitud de la cadena de ceramida a la membrana del reticle endoplasmàtic és crítica per a aquesta selectivitat de classificació. El nostre estudi proporciona la primera evidència directa in vivo per classificar les càrregues de proteïnes en funció de la longitud de la cadena lipídica en llocs d'exportació selectius a la via secretora.
En les cèl·lules eucariotes, les proteïnes sintetitzades al reticle endoplasmàtic (RE) es classifiquen durant el transport a través de la via secretora per al seu lliurament a la seva destinació cel·lular adequada (1). A més de la classificació mediada per la capa, durant molt de temps s'ha especulat que certs lípids també poden servir com a punts de sortida selectius agrupant-los en dominis de membrana específics d'aquestes proteïnes específiques (2-5). Tanmateix, encara hi ha una manca d'evidència directa in vivo per demostrar aquest possible mecanisme basat en lípids. Per resoldre aquest problema bàsic, vam estudiar en llevats com les proteïnes ancorades amb glicosilfosfatidilinositol (GPI) (GPI-AP) s'exporten diferencialment des del RE. Les GPI-AP són una varietat de proteïnes de la superfície cel·lular connectades a lípids (6, 7). La GPI-AP és una proteïna secretada unida a les làmines externes de la membrana plasmàtica a través de la fracció glicolipídica (àncora GPI). Accepten àncores GPI com a modificacions posttraduccionals conservadores al lumen del RE (8). Després de la unió, la GPI-AP passa a través de l'aparell de Golgi (5, 9) des del RE fins a la membrana plasmàtica. La presència d'àncores GPI fa que la GPI-AP es transporti per separat de les proteïnes secretades transmembrana (incloses altres proteïnes de la membrana plasmàtica) al llarg de la via secretora (5, 9, 10). En les cèl·lules de llevat, les GPI-AP es separen d'altres proteïnes secretades al reticle endoplasmàtic i després s'empaquetan en vesícules úniques embolicades pel complex proteic de recobriment II (COPII) (6, 7). Els determinants d'aquest procés de classificació en el procés d'exportació del RE no estan clars, però s'especula que aquest mecanisme pot requerir lípids, especialment la remodelació estructural de la porció lipídica de l'àncora GPI (5, 8). En el llevat, la remodelació dels lípids del GPI comença immediatament després que el GPI s'uneixi i, en molts casos, fa que la ceramida s'uneixi a l'àcid gras saturat de cadena llarga de 26 carbonis (C26:0) (11, 12). La ceramida C26 és la principal ceramida produïda per cèl·lules de llevat fins ara. Es sintetitza al RE i la major part s'exporta a l'aparell de Golgi a través de vesícules COPII (13). L'exportació de GPI-AP al RE requereix específicament una síntesi contínua de ceramida (14, 15) i, al seu torn, la conversió de ceramida a ceramida d'inositol fosfat (IPC) a l'aparell de Golgi depèn de la síntesi d'àncora GPI (16). Estudis biofísics amb membranes artificials han demostrat que les ceramides de cadena acil molt llarga poden coalescer-se per formar dominis ordenats amb propietats físiques úniques (17, 18). Aquestes dades condueixen a la hipòtesi que la ceramida C26 i la GPI-AP amb la ceramida C26 utilitzen les seves propietats físiques per coalescer-se en regions ordenades o regions en l'entorn lipídic de la membrana del RE relativament desordenat. Està composta principalment per glicerolípids curts i insaturats (C16:1 i C18:1) (19, 20). Aquestes regions es centraran selectivament en llocs de sortida del RE (ERES) específics, on la ceramida i la GPI-AP basada en ceramida es poden cotransportar al Golgi a la mateixa vesícula COPII dedicada (5).
En aquest estudi, hem provat directament aquest mecanisme basat en lípids mitjançant la microscòpia d'imatges en temps real confocal de superresolució (SCLIM), que és una tècnica de microscòpia d'avantguarda que pot observar simultàniament proteïnes marcades amb fluorescència. Les imatges tricolors i tridimensionals (3D) tenen una resolució i una velocitat extremadament altes en cèl·lules vives (21, 22).
Primer vam aplicar la tecnologia SCLIM per definir millor com es va seleccionar la GPI-AP normal amb el grup ceramida C26 a partir de proteïnes secretades transmembrana després de sortir del RE en S. cerevisiae. Per tal de comprovar la classificació del RE, vam utilitzar un sistema genètic que pot visualitzar directament la càrrega recentment sintetitzada que entra al RE in vivo (7, 23). Com a càrrega, vam triar GPI-AP Gas1 basat en ceramida C26 marcat amb proteïna fluorescent verda (GFP) i proteïna secretada transmembrana Mid2 marcada amb proteïna fluorescent d'infraroig proper (iRFP), ambdues dirigides a la membrana plasmàtica (24-26). En el mutant sensible a la temperatura sec31-1, aquestes dues càrregues s'expressen sota un promotor induïble per galactosa i un marcador ERES constitutiu. A la temperatura extrema (37 °C), com que la mutació sec31-1 afecta la funció del component de recobriment de COPII Sec31 per inhibir la germinació de COPII i l'exportació del RE, la càrrega recentment sintetitzada s'acumula al RE (23). Després de refredar-se a baixa temperatura (24 °C), les cèl·lules mutants sec31-1 es van recuperar de la zona secretora i la nova càrrega sintètica acumulada va començar a ser exportada del RE. La visualització CLIM va mostrar que la major part del Gas1-GFP i Mid2-iRFP recentment sintetitzats encara s'acumulaven al RE de les cèl·lules mutants sec31-1 després de la incubació a 37 °C i després s'alliberaven a 24 °C durant 5 minuts (Figura 1). Com que Mid2-iRFP es distribueix per tota la membrana del RE i Gas1-GFP es concentra i es recull a la zona discontínua de la membrana del RE, la seva distribució és completament diferent (Figura 1, A a C i Pel·lícula S1). A més, com es mostra a la Figura 1D, el clúster Gas1-GFP no té Mid2-iRFP. Aquests resultats indiquen que les proteïnes GPI-AP i transmembrana es van separar aviat en diferents regions de la membrana del RE. El clúster Gas1-GFP és adjacent a un ERES específic marcat amb la proteïna de recobriment COPII de mCherry Sec13 (Figura 1, E i F, i pel·lícula S1) (23).
Les cèl·lules sec31-1 expressen secrecions induïdes per galactosa, una ceramida de cadena llarga acil (C26) GPI-AP Gas1-GFP (GPI-AP, verd) i la proteïna transmembrana Mid2-iRFP (TMP, blau), i aquest marcatge ERES constructiu Sec13-mCherry (ERES, magenta) es va incubar a 37 °C durant 30 minuts, es va moure a 24 °C i es va obtenir una imatge mitjançant SCLIM 5 minuts més tard. (A a C) mostra una imatge 2D fusionada o única representativa d'un pla (A), una imatge de projecció 2D de 10 seccions z (B) o una imatge d'hemisferi cel·lular 3D de la càrrega i els marcadors ERES (C). Barra d'escala 1 μm (A i B). La unitat d'escala és de 0,551 μm (C). Gas1-GFP es va detectar en regions o clústers discrets del RE, mentre que Mid2-iRFP es va detectar i es va distribuir per tota la membrana del RE (C). (D) El gràfic mostra la intensitat de fluorescència relativa de Gas1-GFP i Mid2-iRFP al clúster Gas1-GFP al llarg de la línia de fletxa blanca (esquerra). AU, unitat arbitrària. (E i F) representen la imatge 3D que combina les marques goods i ERES. Els clústers Gas1-GFP es van detectar a prop de l'ERES específic. La unitat d'escala és de 0,551 μm. (F) La fletxa blanca sòlida marca el clúster Gas1-GFP associat amb ERES. Els panells central i dret mostren la imatge 3D ampliada fusionada i una vista girada del clúster Gas1-GFP seleccionat.
L'estreta relació espacial entre el clúster Gas1-GFP i un ERES específic indica que Gas1-GFP pot entrar a ERES selectiu, cosa que és diferent de la selectivitat utilitzada per Mid2-iRFP per sortir del RE. Per abordar aquesta possibilitat, vam quantificar la relació ERES per a només un o dos béns (Figura 2, A a C). Vam trobar que la majoria d'ERES (70%) contenen només un tipus de càrrega. La imatge inferior de la Figura 2C mostra dos exemples típics d'ERES amb només Gas1-GFP (Figura 1) o només Mid2-iRFP (Figura 2). En canvi, aproximadament el 20% dels ERES contenen dues càrregues que se superposen a la mateixa àrea. Es va trobar que alguns ERES (10%) contenien dos tipus de càrrega, però estaven aïllats en àrees clarament diferents. Per tant, aquesta anàlisi estadística mostra que després d'exportar el RE, GPI-AP Gas1-GFP i la càrrega transmembrana Mid2-iRFP es divideixen en diferents ERES (Figura 2D). Aquesta eficiència de classificació és molt coherent amb l'anàlisi bioquímica prèvia (6) i la determinació morfològica (7). També podem observar el comportament de la càrrega en quarantena que entra a l'ERES (Figura 2E i Pel·lícula S2). La Figura 2E mostra que només una petita porció de Gas1-GFP (panell 3) o Mid2-iRFP (panell 4) entra a l'ERES per un costat i està confinada en una àrea discreta. El panell 5 de la Figura 2E mostra que Gas1-GFP i Mid2-iRFP de vegades es troben al mateix ERES, però entren per costats diferents i es concentren en regions separades que poden representar diferents vesícules de COPII. També vam confirmar que la separació i classificació observada de GPI-AP Gas1 basada en ceramida C26 com a ERES selectiu és específica perquè una altra càrrega de secreció transmembrana, la proteïna de membrana plasmàtica marcada amb GFP Axl2 (27), que mostra un comportament similar al Mid2-iRFP. (Imatge S1 i Pel·lícula S3). L'Axl2-GFP recentment sintetitzat es distribueix a través de la membrana del RE com Mid2-iRFP (Figura S1, A i B), i està co-localitzat amb Mid2-iRFP a la majoria de ERES (Figura S1, B a D). Els panells 1 i 2 de la Figura 1. S1C mostren dos exemples típics d'ERES on dues càrregues transmembrana se superposen. En aquests casos, ambdues mercaderies entren juntes a l'ERES (Figura S1E, Panell 3 i Pel·lícula S3).
Les cèl·lules sec31-1 que expressen secrecions induïbles de galactosa, Gas1-GFP (GPI-AP, verd) i Mid2-iRFP (TMP, blau) i el marcatge ERES constitutiu Sec13-mCherry (ERES, magenta) es van col·locar a 37 °C. Després d'incubar durant 30 minuts a °C, es mouen a 24 °C per alliberar el bloc de secreció i es visualitzen amb SCLIM després de 20 minuts. (A a C) Imatges de projecció 2D representatives (A; barra d'escala, 1 μm) o imatges d'hemisferi cel·lular 3D (B i C; unitat d'escala, 0,456 μm) de la càrrega i 10 seccions z marcades amb ERES. El panell inferior de (B) i el panell de (C) mostren imatges processades per mostrar només les mercaderies presents a ERES (magenta) [Gas1-GFP (gris) i Mid2-iRFP (blau clar)]. (C) Fletxa oberta: ERES només transporta una peça de càrrega (1 a 4). Fletxa grisa: l'ERES conté càrrega segregada (5). Fletxa blanca sòlida: l'ERES que conté càrrega coubicada. A sota: l'únic ERES seleccionat conté només Gas1-GFP (1) o Mid2-iRFP (2). Barra d'escala, 100 nm. (D) Quantificació de la microfotografia descrita a (C). El percentatge mitjà d'ERES que conté només una càrrega (Gas1-GFP o Mid2-iRFP), càrrega segregada i càrrega superposada. En tres experiments independents, n = 432 en 54 cel·les. Barra d'error = SD. Prova t bilateral no aparellada. *** P = 0,0002. (E) Imatge 3D de l'ERES seleccionat de càrrega en quarantena marcada amb (C). Gas1-GFP (verd) (3) o Mid2-iRFP (blau) (4) entra a l'ERES (magenta) per un costat i està restringit a una petita àrea dins de l'ERES. De vegades, ambdós tipus de càrrega entren al mateix ERES (5) pel mateix costat i queden confinades a una zona aïllada dins de l'ERES. Barra d'escala, 100 nm.
A continuació, vam provar la hipòtesi que la ceramida de cadena acil llarga (C26) present a la membrana del RE impulsa l'agrupació i classificació específiques de Gas1 en ERES selectius. Amb aquesta finalitat, vam utilitzar una soca de llevat modificada GhLag1, en la qual les dues ceramida sintases endògenes Lag1 i Lac1 van ser substituïdes per GhLag1 (l'homòleg Lag1 del cotó), donant lloc a una soca de llevat amb una soca de ceramida a la membrana cel·lular més curta que la de tipus salvatge (Figura 3A) (28). L'anàlisi per espectrometria de masses (MS) va mostrar que en les soques de tipus salvatge, el 95% de la ceramida total és ceramida de cadena molt llarga (C26), mentre que en GhLag1, el 85% de la ceramida és molt llarga (C18 i C16), només el 2% de la ceramida és ceramida de cadena molt llarga (C26). Tot i que les ceramides C18 i C16 són les principals ceramides detectades a la membrana de GhLag1 fins ara, l'anàlisi MS també va confirmar que l'àncora GPI de Gas1-GFP expressada a la soca GhLag1 conté ceramida C26, que és comparable als lípids de tipus salvatge. La qualitat és la mateixa (Fig. 3A) (26). Per tant, això significa que l'enzim remodelant la ceramida Cwh43 és altament selectiu per a la ceramida C26, com es mostra a la Figura 26, incorpora preferentment l'àncora GPI d'una petita quantitat de ceramida C26 a la soca GhLag1. S2 (29). No obstant això, la membrana cel·lular de GhLag1 bàsicament només conté ceramida C18-C16, mentre que Gas1-GFP encara té ceramida C26. Aquest fet fa que aquesta soca sigui una eina ideal per resoldre específicament el problema de la longitud de la cadena acil de la ceramida de membrana al RE. El paper hipotètic de la classe i l'ordenació. A continuació, primer vam estudiar la capacitat de C26 Gas1-GFP per acumular-se en clústers a GhLag1 amb un al·lel mutant sensible a la temperatura de sec31-1 mitjançant microscòpia de fluorescència convencional, on només existeix la cadena llarga (C18-C16) a la membrana del RE (Fig. 3). Vam observar que a sec31-1, la major part de Gas1-GFP es concentrava en clústers, mentre que Gas1-GFP a sec31-1 GhLag1 amb ceramida llarga (C18-C16) a la membrana del RE principalment no es agrupava i es distribuïa en tota la membrana del RE. Per ser precisos, com que l'agrupació basada en ceramida C26 està estretament relacionada amb ERES específics (Figura 1), a continuació vam investigar si aquest procés també pot implicar la funció del mecanisme de proteïna d'exportació del RE. GPI-AP utilitza un sistema COPII especial per a l'exportació del RE, que està regulat activament per la remodelació estructural de Ted1 de la porció de glicà de l'àncora GPI (30, 31). El GPI-glicà recombinant és reconegut pel complex p24 del receptor de càrrega transmembrana, que al seu torn recluta selectivament Lst1, que és una isoforma específica de la principal subunitat d'unió a la càrrega de COPII Sec24, formant una COPII rica en GPI-AP. Calen vesícules (31-33). Per tant, vam construir un doble mutant que combinava l'eliminació d'aquestes proteïnes individuals (el component del complex p24 Emp24, l'enzim remodelant el GPI-glicà Ted1 i la subunitat específica de COPII Lst1) amb la soca mutant sec31-1, i les vam estudiar. És possible formar GFP de clúster Gas1 (Figura 3). Vam observar que en sec31-1emp24Δ i sec31-1ted1Δ, Gas1-GFP està principalment desagrupat i distribuït per tota la membrana del RE, com s'havia vist anteriorment en sec31-1 GhLag1, mentre que en sec31-1lst1Δ, Gas1-GFP com sec31-1. Aquests resultats indiquen que, a més de la presència de ceramida C26 a la membrana del RE, l'agrupació de Gas1-GFP també s'ha d'unir al complex p24 i no requereix un reclutament específic de Lst1. A continuació, vam explorar la possibilitat que la longitud de la cadena de ceramida a la membrana del RE pugui regular la unió de Gas1-GFP a p24. Tanmateix, vam trobar que la presència de ceramida C18-C16 a la membrana no afecta els GPI-glicans reconstruïts pel complex p24 (Figures S3 i S4, A i B) ni la unió a GPI-AP i l'exportació de GPI-AP. Capacitat de reclutar el subtipus Lst1 de COPII (Figura S4C). Per tant, l'agrupació dependent de ceramida C26 no requereix interaccions de proteïnes amb diferents mecanismes de proteïnes d'exportació del RE, però admet un mecanisme de classificació alternatiu impulsat per la longitud dels lípids. A continuació, vam analitzar si la longitud de la cadena acil de ceramida a la membrana del RE és important per a la classificació efectiva de Gas1-GFP com a ERES selectiu. Com que el Gas1 de la soca GhLag1 amb ceramida de cadena curta surt del RE i entra a la membrana plasmàtica (Figura S5), creiem que si la classificació està impulsada per la longitud de la cadena acil de ceramida, el Gas1 de la soca GhLag1 es pot redirigir i creuar. Béns ERES amb la mateixa membrana.
(A) La membrana cel·lular de GhLag1 conté principalment ceramides C18-C16 més curtes, mentre que l'àncora GPI de Gas1-GFP encara té el mateix IPC C26 que les cèl·lules de tipus salvatge. A dalt: anàlisi de la longitud de la cadena acil de la ceramida a la membrana cel·lular de les soques de tipus salvatge (Wt) i GhLag1p per espectrometria de masses (MS). Les dades representen el percentatge de ceramida total. La mitjana de tres experiments independents. Barra d'error = SD. Prova t bilateral no aparellada. **** P <0,0001. Panell inferior: anàlisi MS de la longitud de la cadena acil de l'IPC present a l'àncora GPI Gas1-GFP (GPI-IPC) expressada a les soques de tipus salvatge i GhLag1p. Les dades representen el percentatge del senyal IPC total. Mitjana de cinc experiments independents. Barra d'error = SD. Prova t bilateral no aparellada. ns, no important. P = 0,9134. (B) Micrografies de fluorescència de cèl·lules sec31-1, sec31-1 GhLag1, sec31-1emp24Δ, sec31-1ted1Δ i sec31-1lst1Δ que expressaven Gas1-GFP induït per galactosa es van incubar a 37 °C durant 30 minuts i es van passar a... Realitzar microscòpia de fluorescència rutinària després de 24 °C. Fletxa blanca: clúster de Gas1-GFP del RE. Fletxa oberta: la Gas1-GFP no agrupada es distribueix per tota la membrana del RE, mostrant la tinció de l'anell nuclear característica del RE. Barra d'escala, 5 μm. (C) Quantificació de la microfotografia descrita a (B). El percentatge mitjà de cèl·lules amb estructura puntejada de Gas1-GFP. En tres experiments independents, n ≥ 300 cèl·lules. Barra d'error = SD. Prova t no aparellada de dues cues. **** P <0,0001.
Per resoldre directament aquest problema, vam realitzar una visualització SCLIM de Gas1-GFP i Mid2-iRFP a GhLag1 amb l'al·lel mutant sensible a la temperatura sec31-1 (Figura 4 i Pel·lícula S4). Després que el RE es retingués a 37 °C i posteriorment s'alliberés a 24 °C, la major part del Gas1-GFP recentment sintetitzat no es va agrupar ni distribuir per tota la membrana del RE, tal com s'observava amb microscopis convencionals (Figura 4, A i B). A més, un gran percentatge d'ERES (67%) inclou dos tipus de càrrega coubicada en ell (Figura 4D). Els panells 1 i 2 de la Figura 4C mostren dos exemples típics d'ERES amb Gas1-GFP i Mid2-GFP superposats. A més, ambdós béns es van reclutar al mateix ERES (Figura 4E, panell 3 i pel·lícula S4). Per tant, els nostres resultats indiquen que la longitud de la cadena acil de ceramida a la membrana del RE és un determinant important de l'agregació i la classificació de proteïnes del RE.
Cèl·lules Sec31-1 GhLag1 que expressen secrecions induïdes per galactosa, Gas1-GFP (GPI-AP, verd) i Mid2-iRFP (TMP, blau) i Sec13-mCherry marcat amb ERES constitutiu (ERES, magenta). Incubar a 37 °C. Continuar durant 30 minuts, baixar a 24 °C per alliberar secrecions i obtenir la imatge amb SCLIM després de 20 minuts. (A a C) Imatges de projecció 2D representatives (A; barra d'escala, 1 μm) o imatges d'hemisferi cel·lular 3D (B i C; unitat d'escala, 0,45 μm) de les 10 seccions z marcades per càrrega i ERES. El panell inferior a (B) i el panell a (C) mostren imatges processades per mostrar només els béns presents a ERES (magenta) [Gas1-GFP (gris) i Mid2-iRFP (blau clar)]. (C) Fletxa blanca plena: ERES, els béns se superposen. Fletxa oberta: l'ERES només conté un element. Panell inferior: l'ERES seleccionat té mercaderies superposades (1 i 2) marcades a (C). Barra d'escala, 100 nm. (D) Quantificació de la microfotografia descrita a (C). A les unitats sec31-1 i sec31-1 GhLag1, només s'inclou una càrrega (Gas1-GFP o Mid2-iRFP), i el percentatge mitjà d'ERES per a càrrega aïllada i càrrega superposada. En tres experiments independents, n = 432 en 54 cel·les (sec31-1) i n = 430 en 47 cel·les (sec31-1 GhLag1). Barra d'error = SD. Prova t bilateral no aparellada. *** P = 0,0002 (sec31-1) i ** P = 0,0031 (sec31-1 GhLag1). (E) Imatge 3D de l'ERES seleccionat amb càrrega superposada (3) marcada a (C). Gas1-GFP (verd) i Mid2-iRFP (blau) s'acosten a ERES (magenta) des del mateix costat i romanen a la mateixa àrea restringida d'ERES. Barra d'escala, 100 nm.
Aquest estudi proporciona evidència directa in vivo que les càrregues de proteïnes basades en lípids es classifiquen en llocs d'exportació selectius a la via secretora, i revela la importància de la longitud de la cadena acil per a la selectivitat de classificació. Mitjançant una tècnica de microscòpia potent i d'avantguarda anomenada SCLIM, vam demostrar la Gas1-GFP recentment sintetitzada (una GPI-AP important de la membrana plasmàtica amb una porció lipídica de ceramida de cadena acil (C26) molt llarga) en llevat). Les regions agrupades en RE discrets s'associen amb ERES específics, mentre que les proteïnes secretades transmembrana es distribueixen per tota la membrana del RE (Figura 1). A més, aquests dos tipus de productes entren selectivament en diferents ERES (Figura 2). La longitud de la cadena acil de la ceramida cel·lular a la membrana es redueix de C26 a C18-C16, el clúster Gas1-GFP es desintegra a la regió discreta del RE i la Gas1-GFP es redirigeix ​​per sortir del RE amb la proteïna transmembrana a través del mateix ERES (Figura 3 i Figura 3). 4).
Tot i que la GPI-AP utilitza un mecanisme proteic especialitzat per sortir del RE, vam descobrir que la separació dependent de ceramida C26 no es basa en interaccions diferencials de proteïnes que puguin conduir a l'especialització de l'ERES (Figures S4 i S5). En canvi, les nostres troballes donen suport a un mecanisme de classificació alternatiu impulsat per l'agrupació de proteïnes basada en lípids i la posterior exclusió d'altres càrregues. Les nostres observacions indiquen que la regió o clúster Gas1-GFP associat amb un ERES específic no té la proteïna secretada transmembrana Mid2-iRFP, la qual cosa indica que el clúster GPI-AP dependent de ceramida C26 facilitarà la seva entrada al ERES rellevant i, alhora, exclourà les secrecions transmembrana. Les secrecions entren en aquest ERES en particular (Figures 1 i 2). En canvi, la presència de ceramides C18-C16 a la membrana del RE no fa que la GPI-AP formi regions o clústers, de manera que no exclouen ni substitueixen les proteïnes secretades transmembrana al mateix ERES (Figures 3 i 4). Per tant, proposem que la ceramida C26 impulsa la separació i la classificació facilitant l'agrupació de proteïnes lligades a ERES específics.
Com aconseguir aquesta agrupació dependent de la ceramida C26 en una àrea específica del RE? La tendència de la ceramida de membrana a separar-se lateralment pot fer que la GPI-AP i la ceramida C26 formin lípids petits i ordenats instantàniament en l'entorn lipídic més irregular de la membrana del RE que conté glicerolípids més curts i insaturats. Clústers de qualitat (17, 18). Aquests petits clústers temporals es poden fusionar encara més en clústers més grans i estables després d'unir-se al complex p24 (34). D'acord amb això, vam demostrar que la C26 Gas1-GFP necessita interactuar amb el complex p24 per formar clústers visibles més grans (Figura 3). El complex p24 és un oligòmer heterozigot compost per quatre proteïnes transmembrana p24 diferents en llevat (35), que proporciona una unió multivalent, que pot conduir a l'enllaç creuat de petits clústers de GPI-AP, generant així un clúster estable més gran (34). La interacció entre els ectodominis proteics de les GPI-AP també pot contribuir a la seva agregació, com es mostra durant el seu transport a l'aparell de Golgi en cèl·lules epitelials polaritzades de mamífers (36). Tanmateix, quan la ceramida C18-C16 és present a la membrana del RE, quan el complex p24 s'uneix a Gas1-GFP, no es formaran grans clústers separats. El mecanisme subjacent pot dependre de les propietats físiques i químiques específiques de la ceramida de cadena acil llarga. Els estudis biofísics de membranes artificials mostren que, tot i que tant les ceramides de cadena acil llarga (C24) com les curtes (C18-C16) poden causar la separació de fases, només les ceramides de cadena acil llarga (C24) poden promoure una alta curvatura i flexió de la pel·lícula per remodelar-la mitjançant una referència mútua (17, 37, 38). S'ha demostrat que l'hèlix transmembrana de TMED2, l'homòleg humà d'Emp24, interactua selectivament amb l'esfingomielina basada en ceramida C18 als lòbuls citoplasmàtics (39). Mitjançant simulacions de dinàmica molecular (MD), vam trobar que tant les ceramides C18 com les C26 s'acumulen al voltant dels lòbuls citoplasmàtics de l'hèlix transmembrana d'Emp24, i tenen preferències similars (Figura S6). Val la pena assenyalar que això indica que l'hèlix transmembrana d'Emp24 pot conduir a una distribució asimètrica de lípids a la membrana. Aquest és un resultat recent basat en cèl·lules de mamífers. Simulacions MD similars també mostren la presència d'èters lipídics (40). Per tant, especulem que la ceramida C26 als dos lòbuls d'ER26 està enriquida localment. Quan la GPI-AP als lòbuls luminals s'uneix directament a la p24 multivalent i l'acumulació de ceramida C26 al voltant de la p24 als lòbuls citoplasmàtics, pot promoure l'agregació de proteïnes i la generació de curvatura de la membrana a través dels dits (41), cosa que fa que la GPI-AP se separi en regions discretes adjacents a l'ER, cosa que també afavoreix les regions altament corbes de la membrana del RE (42). Informes anteriors van recolzar el mecanisme proposat (43, 44). La unió multivalent d'oligolectines, patògens o anticossos a glicoesfingolípids (GSL) basats en ceramides a la membrana plasmàtica desencadena una gran agregació de GSL, millora la separació de fases i provoca la deformació i internalització de la membrana (44). Iwabuchi etc. (43) Es va trobar que en presència de cadenes acil llargues (C24) però no curtes (C16), el lligand multivalent unit a la lactosilceramida GSL induïa la formació de grans cúmuls i invaginació de membrana, i la transducció del senyal mediada per Lyn del citoplasma a les làmines està interdigitada per cadenes acil en neutròfils acoblats.
En les cèl·lules epitelials polaritzades dels mamífers, la concentració de la xarxa anti-Golgi (TGN) al nivell de la membrana plasmàtica apical controla la separació i classificació de GPI-AP (10, 45). Aquesta agregació està impulsada per l'oligomerització de GPI-AP (36), però també pot dependre de la longitud de la cadena de ceramida que trobem en el llevat. Tot i que la GPI-AP dels mamífers té una àncora lipídica èter, i la seva estructura química és molt diferent de la ceramida de cadena acil molt llarga, un estudi recent va trobar que ambdós lípids tenen propietats físiques i químiques i una funció evolutivament similars (40). Per tant, la part lipídica èter en les cèl·lules dels mamífers pot ser similar a la ceramida C26 en el llevat, i el seu paper és associar-se amb la ceramida de cadena llarga a la membrana per promoure l'agregació i la classificació de GPI-AP. Tot i que aquesta possibilitat encara s'ha de provar directament, troballes prèvies donen suport a que el transport de la ceramida de cadena acil llarga al cos de Golgi no es duu a terme mitjançant proteïnes de transferència citoplasmàtiques, sinó que depèn de la síntesi d'àncores GPI com el llevat. Per tant, el mecanisme conservador evolutiu sembla ser capaç de cotransportar selectivament ceramida de cadena acil molt llarga i GPI-AP (13, 16, 20, 46, 47) en la mateixa vesícula de transport.
En els sistemes de cèl·lules epitelials polaritzades de llevats i mamífers, l'agregació i separació de GPI-AP d'altres proteïnes de la membrana plasmàtica es produeixen abans d'arribar a la superfície cel·lular. Paladino et al. (48) van descobrir que al TGN de ​​les cèl·lules epitelials polaritzades de mamífers, l'agrupació de GPI-AP no només és necessària per a la classificació selectiva de les GPI-AP a la membrana plasmàtica apical, sinó que també regula l'organització en clústers de les GPI-AP i la seva activitat biològica. Superfície cel·lular. En llevats, aquest estudi va demostrar que el clúster de GPI-AP dependent de ceramida C26 al RE pot regular l'organització en clústers i l'activitat funcional de GPI-AP a la membrana plasmàtica (24, 49). D'acord amb aquest model, les cèl·lules GhLag1 són al·lèrgiques als inhibidors de GPI o fàrmacs que afecten la integritat de la paret cel·lular (28), i la necessitat de clústers funcionals de Gas1-GFP (49) de la ceramida de la punta projectada en l'aparellament de les cèl·lules de llevat indica possibles conseqüències fisiològiques de les cèl·lules hLag1. Error de GPI-AP. Tanmateix, l'objecte de la nostra futura recerca serà comprovar si l'organització funcional de la superfície cel·lular s'ha programat des del RE mitjançant un mètode de classificació basat en la longitud dels lípids.
Les soques de Saccharomyces cerevisiae utilitzades en aquest treball es mostren a la Taula S1. Les soques MMY1583 i MMY1635 de SCLIM per a imatges de cèl·lules vives es van construir en segon pla de W303. Aquestes soques que expressen Sec13-mCherry amb una etiqueta de proteïna fluorescent es van construir mitjançant un mètode basat en la reacció en cadena de la polimerasa (PCR) amb el plasmidi pFA6a com a plantilla (23). La soca que expressa Mid2-iRFP marcada amb proteïna fluorescent sota el control del promotor GAL1 es va construir de la següent manera. Amplificació per PCR de la seqüència iRFP-KanMx del vector pKTiRFP-KAN (regal d'E. O'Shea, plasmidi Addgene número 64687; http://n2t.net/addgene: 64687; identificador de recursos de recerca (RRID): Addgene_64687) i inserida al C-terminal de Mid2 endògen. Després que la seqüència del genoma Mid2-iRFP fos amplificada i clonada al promotor GAL1, es va integrar al lloc Not I-Sac I del plasmidi d'integració pRS306. El plasmidi resultant pRGS7 es va linealitzar amb Pst I per integrar-se al locus URA3.
El gen de fusió Gas1-GFP s'expressa sota el control del promotor GAL1 al plasmidi del centròmer (CEN), que es construeix de la següent manera. La seqüència Gas1-GFP es va amplificar per PCR a partir del plasmidi pRS416-GAS1-GFP (24) (regal de L. Popolo) i es va clonar al lloc Xma I-Xho I del plasmidi CEN pBEVY-GL LEU2 (regal de C). Miller; plasmidi Addgene número 51225; http://n2t.net/addgene: 51225; RRID: Addgene_51225). El plasmidi resultant es va anomenar pRGS6. El gen de fusió Axl2-GFP també s'expressa sota el control del promotor GAL1 del vector pBEVY-GL LEU2, i la seva construcció és la següent. La seqüència Axl2-GFP es va amplificar a partir del plasmidi pRS304-p2HSE-Axl2-GFP (23) mitjançant PCR i es va clonar al lloc Bam HI-Pst I del vector pBEVY-GL LEU2. El plasmidi resultant es va anomenar pRGS12. La seqüència dels oligonucleòtids utilitzats en aquest estudi es mostra a la Taula S2.
La soca es va suplementar amb un 0,2% d'adenina i un 2% de glucosa [YP-dextrosa (YPD)], un 2% de rafinosa [YP-raffinosa], un medi proteic d'extracte de llevat ric en proteïna p (YP) (1% d'extracte de llevat i 2% de proteïna ept). (YPR)] o un 2% de galactosa [YP-galactosa (YPG)] com a font de carboni, o en un medi mínim sintètic (0,15% de base nitrogenada de llevat i 0,5% de sulfat d'amoni) per suplementar els aminoàcids i les bases apropiats necessaris per a la nutrició, i que contenia un 2% de glucosa (medi mínim de glucosa sintètica) o un 2% de galactosa (medi mínim de galactosa sintètica) com a font de carboni.
Per a la imatge en temps real, les cèl·lules mutants sec31-1 sensibles a la temperatura que expressaven la construcció sota el promotor GAL1 es van cultivar en medi YPR a 24 °C durant la nit fins a la fase logarítmica mitjana. Després de la inducció en YPG a 24 °C durant 1 hora, les cèl·lules es van incubar en SG a 37 °C durant 30 minuts i després es van transferir a 24 °C per alliberar-les del bloc de secreció. Es va utilitzar concanavalina A per fixar les cèl·lules en un portaobjectes de vidre i es van obtenir imatges mitjançant SCLIM. SCLIM és una combinació del microscopi de fluorescència invertit Olympus IX-71 i la lent d'oli d'obertura numèrica UPlanSApo 100×1.4 (Olympus), un escàner confocal de disc giratori d'alta velocitat i alta relació senyal-soroll (Yokogawa Electric), un espectròmetre personalitzat i refrigeració personalitzada. L'intensificador d'imatges del sistema (Hamamatsu Photonics) pot proporcionar un sistema de lents d'augment amb un augment final de ×266.7 i una càmera de dispositiu d'acoblament de càrrega que multiplica els electrons (Hamamatsu Photonics) (21). L'adquisició d'imatges es realitza mitjançant un programari personalitzat (Yokogawa Electric). Per a les imatges en 3D, vam utilitzar un actuador piezoelèctric fet a mida per fer vibrar la lent de l'objectiu verticalment i vam recollir les parts òptiques separades per 100 nm en una pila. La imatge de la pila Z es converteix en dades de vòxel en 3D i la funció de dispersió de punts teòrica utilitzada per al microscopi confocal de disc giratori s'utilitza per al processament de deconvolució mitjançant el programari Volocity (PerkinElmer). Mitjançant l'ús del programari Volocity per establir automàticament el llindar per a l'anàlisi de co-ubicació, es va mesurar l'ERES, inclosa la càrrega. L'anàlisi d'escaneig lineal es va realitzar amb el programari MetaMorph (Molecular Devices).
Utilitzeu el programari GraphPad Prism per determinar la significació estadística. Per a la prova t de Student bilateral i la prova d'anàlisi de la variància (ANOVA) ordinària, es considera que les diferències entre grups tenen un impacte significatiu en P <0,05 (*).
Per a la microscòpia de fluorescència de Gas1-GFP, les cèl·lules en fase logarítmica es van cultivar durant la nit en YPD i es van recollir per centrifugació, es van rentar dues vegades amb solució salina tamponada amb fosfat i es van incubar en gel durant almenys 15 minuts, i després es van processar sota el microscopi tal com s'ha descrit anteriorment a la Comprovació (24). Per a l'adquisició es va utilitzar el microscopi Leica DMi8 (HCX PL APO 1003/1.40 oil PH3 CS) equipat amb una lent objectiu, un filtre L5 (GFP), una càmera Hamamatsu i el programari Application Suite X (LAS X).
Les mostres es van desnaturalitzar amb tampó de mostra SDS a 65 °C durant 10 minuts i després es van separar mitjançant electroforesi en gel de poliacrilamida-SDS (PAGE). Per a l'anàlisi d'immunoblotting, es van carregar 10 μl de mostra per carril. Anticòs primari: utilitzeu anti-Gas1 policlonal de conill a una dilució d'1:3000, anti-Emp24 policlonal de conill a una dilució d'1:500 i anti-GFP policlonal de conill (un regal de H. Riezman) a una dilució d'1:3000. L'anticòs monoclonal de ratolí anti-Pgk1 es va utilitzar a una dilució d'1:5000 (un regal de J. de la Cruz). Anticòs secundari: immunoglobulina G de cabra anti-conill (IgG) conjugada amb peroxidasa de rave picant (HRP) utilitzada a una dilució d'1:3000 (Pierce). Es va utilitzar IgG de cabra anti-ratolí conjugada amb HRP a una dilució d'1:3000 (Pierce). La zona de resposta immunitària es va observar mitjançant el mètode de quimioluminescència del reactiu SuperSignal West Pico (Thermo Fisher Scientific).
Com es descriu a (31), es va dur a terme un experiment d'immunoprecipitació natural sobre la fracció RE enriquida. En resum, es van rentar les cèl·lules de llevat amb tampó TNE [50 mM tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM fluorur de fenilmetilsulfonil i barreja d'inhibidors de proteasa) a 600 nm (DO600) a una densitat òptica de 100 dues vegades. Es va trencar amb perles de vidre i després es van eliminar les restes cel·lulars i les perles de vidre per centrifugació. El sobrenedant es va centrifugar a 17.000 g durant 15 minuts a 4 °C. El pellet es va resuspendre en TNE i es va afegir saponina digital fins a una concentració final de l'1%. La suspensió es va incubar durant 1 hora amb rotació a 4 °C i després es van eliminar els components insolubles per centrifugació a 13.000 g a 4 °C durant 60 minuts. Per a la immunoprecipitació amb Gas1-GFP, primer preincubeu la mostra amb perles d'agarosa buides (ChromoTek) a 4 °C durant 1 hora i, a continuació, incubeu-la amb GFP-Trap_A (ChromoTek) a 4 °C durant 3 hores. Les perles immunoprecipitades es van rentar cinc vegades amb TNE que contenia un 0,2% de digoxigenina, es van eluir amb tampó de mostra SDS, es van separar en SDS-PAGE i es van analitzar mitjançant immunotransferència.
Com es descriu a (31), la determinació de l'entrecreuament es va dur a terme sobre la fracció d'ER enriquida. Breument, la fracció d'ER enriquida es va incubar amb 0,5 mM de ditiobis(succinimidil propionat) (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, EUA; 20 °C, 20 min). La reacció d'entrecreuament es va aturar afegint glicina (concentració final de 50 mM, 5 minuts, 20 °C).
Com s'ha descrit anteriorment (50), es va realitzar una anàlisi MS de ceramida en soques de tipus salvatge i GhLag1. En resum, les cèl·lules es van fer créixer fins a la fase exponencial (3 a 4 unitats OD600/ml) en YPD a 30 °C i es van recollir 25 × 107 cèl·lules. El seu metabolisme es va aturar amb àcid tricloroacètic. Utilitzeu un dissolvent d'extracció [etanol, aigua, èter, piridina i hidròxid d'amoni 4,2 N (15:15:5:1:0,018 v/v)] i 1,2 nmol de ceramida C17 estàndard intern (860517, Avanti polar lipid). Utilitzeu el reactiu de monometilamina [metanol, aigua, n-butanol i solució de metilamina (4:3:1:5 v/v)] per realitzar una hidròlisi alcalina suau de l'extracte i, a continuació, utilitzeu n-butanol saturat d'aigua per dessalar. Finalment, l'extracte es va resuspendre en un dissolvent de mode positiu [cloroform/metanol/aigua (2:7:1) + 5 mM d'acetat d'amoni] i es va injectar a l'espectròmetre de masses. Es va realitzar un monitoratge multireacció (MRM) per a la identificació i quantificació de molècules d'esfingolípids. L'espectròmetre de masses quadrupol terciari TSQ Vantage (Thermo Fisher Scientific) està equipat amb una font d'ions de nanoflux robòtica Nanomate HD (Advion Biosciences, Ithaca, NY) per a l'anàlisi de lípids. L'energia de col·lisió està optimitzada per a cada categoria de ceramida. Les dades de MS es van obtenir en mode positiu. Per a cada rèplica biològica, el senyal lipídic és la mitjana de tres mesures independents.
Com es descriu a (31), les cèl·lules (800 × 107) que expressaven Gas1-GFP es van sotmetre a immunoprecipitació natural. El Gas1-GFP purificat es va separar mitjançant SDS-PAGE i es va transferir a una membrana de fluorur de polivinilidè (PVDF). La proteïna es va visualitzar tenyint PVDF amb negre d'amida. La banda de Gas1-GFP es va tallar del PVDF i es va rentar 5 vegades amb metanol i una vegada amb aigua de grau cromatografia líquida-MS (LC-MS). Incubant la tira de membrana amb 500 μl de NaOAc 0,3 M (pH 4,0), tampó i 500 μl de mescla de nitrit de sodi 1 M recentment dissolta a 37 °C durant 3 hores, la fracció lipídica s'allibera de Gas1-GFP i es lisa entre glucosamina i inositol (51). Alliberament de ceramida de fosfat d'inosina. Després d'això, la tira de membrana es va rentar quatre vegades amb aigua de grau LC-MS, es va assecar a temperatura ambient i es va emmagatzemar en una atmosfera de nitrogen a -80 °C fins a l'anàlisi. Com a control, es va utilitzar una mostra en blanc de membrana de PVDF per a cada experiment. El lípid extret de Gas1-GFP es va analitzar mitjançant MS tal com es descriu (50). En resum, les tires de PVDF que contenien lípid GPI es van resuspendre en 75 μl de dissolvent de motlle negatiu [cloroform/metanol (1:2) + 5 mM d'acetat d'amoni] i es van sotmetre a l'anàlisi d'espècies d'esfingolípids per ionització per electroaspersió (ESI)-MRM/MS (TSQ Vantage). En aquest cas, les dades de MS es van obtenir en mode d'ions negatius.
Com s'ha esmentat anteriorment, la porció lipídica de l'àncora GPI es va separar del GPI-AP marcat amb [3H]-inositol (16). Els lípids es van separar mitjançant cromatografia de capa fina utilitzant un sistema de dissolvents (55:45:10 cloroform-metanol-0,25% KCl) i es van visualitzar utilitzant FLA-7000 (Fujifilm).
Les cèl·lules que expressaven Gas1-GFP (600×107) es van rentar dues vegades amb tampó TNE, es van trencar amb perles de vidre i després es van centrifugar per eliminar les restes cel·lulars i les perles de vidre. El sobrenedant es va centrifugar a 17.000 g durant 1 hora a 4 °C. El pellet es va rentar en TNE i es va incubar amb 1 U de PI-PLC (Invitrogen) en TNE que contenia 0,2% de saponina digital durant 1 hora a 37 °C. Després del tractament enzimàtic, la membrana es va eliminar per centrifugació a 17.000 g a 4 °C durant 1 hora. Per immunoprecipitar Gas1-GFP, el sobrenedant es va incubar amb GFP-Trap_A (ChromoTek) a 4 °C durant la nit. El Gas1-GFP purificat separat per SDS-PAGE es va tenyir amb blau brillant de Coomassie. La banda de tinció de Gas1-GFP es va tallar del gris que envoltava l'aqüeducte i, després de l'alquilació amb iodoacetamida i la reducció amb ditiotreitol, es va realitzar una digestió en gel amb tripsina. Extreure i assecar els pèptids tríptics i els pèptids amb GPI-glicans. El pèptid assecat es va dissoldre en 20 μl d'aigua. Injectar una porció (8 μl) a la LC. Es va utilitzar una columna d'octadecilsilà (ODS) (Develosil 300ODS-HG-5; diàmetre interior 150 mm × 1,0 mm; Nomura Chemical, Prefectura d'Aichi, Japó) per separar els pèptids en condicions de gradient específiques. La fase mòbil és el dissolvent A (0,08% d'àcid fòrmic) i el dissolvent B (0,15% d'àcid fòrmic en 80% d'acetonitril). Es va utilitzar un sistema Accela HPLC (Thermo Fisher Scientific, Boston, Massachusetts) per eluir la columna amb el dissolvent A en 55 minuts a un cabal de 50 μl min-1 durant 5 minuts, i després es va augmentar la concentració del dissolvent B fins al 40%. , Estats Units). L'eluat es va introduir contínuament a la font d'ions ESI, i els pèptids tríptics i els pèptids amb GPI-glicans es van analitzar mitjançant LTQ Orbitrap XL (espectròmetre de masses híbrid lineal de trampa d'ions-orbitrap; Thermo Fisher Scientific). En la configuració MS, el voltatge de la font capil·lar es va establir a 4,5 kV, i la temperatura del capil·lar de transferència es va mantenir a 300 °C. El voltatge capil·lar i el voltatge de la lent del tub es van establir a 15 V i 50 V, respectivament. Les dades de MS es van obtenir en el mode d'ions positius (resolució de 60.000; precisió de massa de 10 parts per milió) en un rang de masses de 300/m/z amb una relació massa/càrrega (m/z) de 3000. Les dades de MS/MS s'obtenen a través de la trampa d'ions del LTQ Orbitrap XL [els 3 primers dígits dels quals depenen les dades, dissociació induïda per col·lisió (CID)].
Les simulacions de MD es van dur a terme utilitzant el programari GROMACS (52) i el camp de força MARTINI 2 (53-55). A continuació, es va utilitzar el constructor de membranes CHARMM GUI (56, 57) per construir una bicapa que contenia dioleoilfosfatidilcolina (DOPC) i Cer C18 o DOPC i Cer C26. La topologia i les coordenades de Cer C26 es deriven de DXCE eliminant les perles addicionals de la cua d'esfingosina. Utilitzeu el procés descrit a continuació per equilibrar la doble capa i executar-la, i després utilitzeu les últimes coordenades del sistema per construir un sistema que contingui Emp24. El domini transmembrana del llevat Emp24 (residus 173 a 193) es va construir com una hèlix α utilitzant l'estructura molecular de l'eina visual MD (VMD) (58). Després, després d'eliminar els lípids superposats, la proteïna es va granular gruixudament i es va inserir a la bicapa mitjançant la GUI CHARMM. El sistema final conté 1202 DOPC i 302 Cer C26 o 1197 DOPC i 295 Cer C18 i Emp24. Ionitzeu el sistema a una concentració de 0,150 M. Es van fer quatre rèpliques independents per a dues composicions de bicapa.
La bicapa lipídica s'equilibra mitjançant el procés GUI CHARMM, que implica minimitzar i després equilibrar 405.000 passos, on les restriccions de posició es redueixen i s'eliminen gradualment, i el pas de temps s'augmenta de 0,005 ps a 0,02 ps. Després de l'equilibri, produeix 6 µs amb un pas de temps de 0,02 ps. Després d'inserir Emp24, utilitzeu el mateix procés GUI CHARMM per minimitzar i equilibrar el sistema i després executeu-lo durant 8 s en producció.
Per a tots els sistemes, durant el procés d'equilibri, la pressió es controla mitjançant el baròstat Berendsen (59), i durant el procés de producció, la pressió es controla mitjançant el baròstat Parrinello-Rahman (60). En tots els casos, la pressió mitjana és d'1 bar i s'utilitza un esquema d'acoblament de pressió semiisotròpic. En el procés d'equilibri i producció, s'utilitza un termòstat (61) amb recalibratge de velocitat per acoplar la temperatura de les partícules de proteïna, lípid i dissolvent respectivament. Durant tota l'operació, la temperatura objectiu és de 310 K. La interacció sense enllaç es calcula generant una llista d'aparellament utilitzant l'esquema de Verlet amb una tolerància de tampó de 0,005. El terme de Coulomb es calcula utilitzant el camp de reacció i una distància de tall d'1,1 nm. El terme de Vander Waals utilitza un esquema de tall amb una distància de tall d'1,1 nm, i l'esquema de tall de Verlet s'utilitza per a la deriva potencial (62).
Utilitzant VMD, la longitud d'ona de tall entre les perles de fosfat DOPC o les perles de ceramida AM1 i la proteïna és de 0,7 nm, i es calcula el nombre de lípids que interactuen amb la proteïna. Segons la fórmula següent, calculeu el factor d'enriquiment per depleció (DE) com a (63): Factor DE = (la quantitat de lípids totals a la proteïna 0,7) a la proteïna 0,7 (la quantitat de Cer en els lípids totals)
El valor reportat s'obté com a mitjana, i les barres d'error són quatre còpies independents de l'estat estadístic estàndard. La significació estadística del factor DE es calcula mitjançant la prova t [(factor DE mitjà-1)/estat estadístic estàndard]. Calculeu el valor P a partir de la distribució unilateral.
L'eina GROMACS es va utilitzar per calcular el mapa de densitat lateral 2D del sistema que conté Emp24 dins dels darrers 250 ns del traçat. Per obtenir el mapa d'enriquiment/esgotament de la ceramida, el mapa de densitat de Cer es divideix per la suma del mapa de Cer i DOPC, i després es divideix per la concentració de Cer al cos. S'utilitza la mateixa escala de mapa de colors.
Per a materials complementaris per a aquest article, consulteu http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/50/eaba8237/DC1
Aquest és un article d'accés obert distribuït sota els termes de la Llicència Creative Commons Reconeixement-NoComercial, que permet l'ús, la distribució i la reproducció en qualsevol mitjà, sempre que l'ús final no sigui amb finalitats comercials i la premissa sigui que l'obra original sigui correcta. Referència.
Nota: Només us demanem que proporcioneu la vostra adreça electrònica perquè la persona que recomaneu a la pàgina sàpiga que voleu que vegi el correu electrònic i que no és correu brossa. No capturarem cap adreça electrònica.
Aquesta pregunta s'utilitza per comprovar si sou un visitant i evitar l'enviament automàtic de correu brossa.
Sofia Rodríguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana Maria Pérez -Linero), Sergio Lopez (Sergio Lopez), Ar Miho Waga (Miako) Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
Les imatges 3D d'alta resolució en temps real revelen la importància de la longitud de la cadena de ceramida per a la classificació de proteïnes en llocs de sortida selectius.
Sofia Rodríguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana Maria Pérez -Linero), Sergio Lopez (Sergio Lopez), Ar Miho Waga (Miako) Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
Les imatges 3D d'alta resolució en temps real revelen la importància de la longitud de la cadena de ceramida per a la classificació de proteïnes en llocs de sortida selectius.
©2020 Associació Americana per a l'Avenç de la Ciència. tots els drets reservats. AAAS és soci de HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef i COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.