Gràcies per visitar nature.com. La versió del navegador que esteu utilitzant té compatibilitat limitada amb CSS. Per a una millor experiència, us recomanem que utilitzeu la darrera versió del navegador (o que desactiveu el mode de compatibilitat a l'Internet Explorer). A més, per garantir una compatibilitat continuada, aquest lloc no inclourà estils ni JavaScript.
El sulfur d'hidrogen (H2S) té múltiples efectes fisiològics i patològics sobre el cos humà. L'hidrosulfur de sodi (NaHS) s'utilitza àmpliament com a eina farmacològica per avaluar els efectes de l'H2S en experiments biològics. Tot i que la pèrdua d'H2S de les solucions de NaHS només triga uns minuts, les solucions de NaHS s'han utilitzat com a compostos donants per a l'H2S en l'aigua potable en alguns estudis amb animals. Aquest estudi va investigar si l'aigua potable amb una concentració de NaHS de 30 μM preparada en ampolles de rata/ratolí podia romandre estable durant almenys 12-24 hores, tal com suggereixen alguns autors. Prepareu una solució de NaHS (30 μM) en aigua potable i aboqueu-la immediatament en ampolles d'aigua de rata/ratolí. Es van recollir mostres de la punta i de l'interior de l'ampolla d'aigua a les 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 12 i 24 hores per mesurar el contingut de sulfur mitjançant el mètode del blau de metilè. A més, es va injectar NaHS (30 μM) a rates mascles i femelles durant dues setmanes i es van mesurar les concentracions de sulfur sèric cada dos dies durant la primera setmana i al final de la segona setmana. La solució de NaHS a la mostra obtinguda de la punta de l'ampolla d'aigua era inestable; va disminuir un 72% i un 75% després de 12 i 24 hores, respectivament. En mostres obtingudes de l'interior de les ampolles d'aigua, la disminució de NaHS no va ser significativa en 2 hores; no obstant això, va disminuir un 47% i un 72% després de 12 i 24 hores, respectivament. La injecció de NaHS no va afectar el nivell de sulfur sèric de rates mascles i femelles. En conclusió, les solucions de NaHS preparades a partir d'aigua potable no s'han d'utilitzar per a la donació d'H2S perquè la solució és inestable. Aquesta via d'administració exposarà els animals a quantitats irregulars i menors de l'esperada de NaHS.
El sulfur d'hidrogen (H2S) s'ha utilitzat com a toxina des del 1700; tanmateix, el seu possible paper com a molècula de biosenyalització endògena va ser descrit per Abe i Kimura el 1996. Durant les últimes tres dècades, s'han dilucidat nombroses funcions de l'H2S en diversos sistemes humans, cosa que ha portat a la conclusió que les molècules donants d'H2S poden tenir aplicacions clíniques en el tractament o la gestió de certes malalties; vegeu Chirino et al. per a una revisió recent.
L'hidrosulfur de sodi (NaHS) s'ha utilitzat àmpliament com a eina farmacològica per avaluar els efectes de l'H2S en molts estudis de cultius cel·lulars i animals5,6,7,8. Tanmateix, el NaHS no és un donant ideal d'H2S perquè es converteix ràpidament en H2S/HS- en solució, es contamina fàcilment amb polisulfurs i s'oxida i volatilitza fàcilment4,9. En molts experiments biològics, el NaHS es dissol en aigua, cosa que provoca volatilització passiva i pèrdua d'H2S10,11,12, oxidació espontània d'H2S11,12,13 i fotòlisi14. El sulfur de la solució original es perd molt ràpidament a causa de la volatilització de l'H2S11. En un recipient obert, la vida mitjana (t1/2) de l'H2S és d'uns 5 minuts i la seva concentració disminueix aproximadament un 13% per minut10. Tot i que la pèrdua de sulfur d'hidrogen de les solucions de NaHS només triga uns minuts, alguns estudis amb animals han utilitzat solucions de NaHS com a font de sulfur d'hidrogen en aigua potable durant 1-21 setmanes, substituint la solució que conté NaHS cada 12-24 hores.15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 Aquesta pràctica no és coherent amb els principis de la investigació científica, ja que les dosis dels fàrmacs s'haurien de basar en el seu ús en altres espècies, especialment en humans.27
La recerca preclínica en biomedicina té com a objectiu millorar la qualitat de l'atenció al pacient o els resultats del tractament. Tanmateix, els resultats de la majoria d'estudis en animals encara no s'han traslladat als humans28,29,30. Una de les raons d'aquest fracàs translacional és la manca d'atenció a la qualitat metodològica dels estudis en animals30. Per tant, l'objectiu d'aquest estudi va ser investigar si les solucions de NaHS de 30 μM preparades en ampolles d'aigua de rata/ratolí podien romandre estables en aigua potable durant 12-24 h, tal com s'afirma o es suggereix en alguns estudis.
Tots els experiments d'aquest estudi es van dur a terme d'acord amb les directrius publicades per a la cura i l'ús d'animals de laboratori a l'Iran31. Tots els informes experimentals d'aquest estudi també van seguir les directrius ARRIVE32. El Comitè d'Ètica de l'Institut de Ciències Endocrines de la Universitat de Ciències Mèdiques Shahid Beheshti va aprovar tots els procediments experimentals d'aquest estudi.
L'acetat de zinc dihidrat (CAS: 5970-45-6) i el clorur fèrric anhidre (CAS: 7705-08-0) es van comprar a Biochem, Chemopahrama (Cosne-sur-Loire, França). L'hidrosulfur de sodi hidratat (CAS: 207683-19-0) i la N,N-dimetil-p-fenilendiamina (DMPD) (CAS: 535-47-0) es van comprar a Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA). L'isoflurà es va comprar a Piramal (Bethlehem, PA, EUA). L'àcid clorhídric (HCl) es va comprar a Merck (Darmstadt, Alemanya).
Prepareu una solució de NaHS (30 μM) en aigua potable i aboqueu-la immediatament a les ampolles d'aigua de rata/ratolí. Aquesta concentració es va escollir basant-se en nombroses publicacions que utilitzen NaHS com a font d'H2S; vegeu la secció Discussió. El NaHS és una molècula hidratada que pot contenir quantitats variables d'aigua d'hidratació (és a dir, NaHS•xH2O); segons el fabricant, el percentatge de NaHS utilitzat en el nostre estudi va ser del 70,7% (és a dir, NaHS•1,3 H2O), i vam tenir en compte aquest valor en els nostres càlculs, on vam utilitzar un pes molecular de 56,06 g/mol, que és el pes molecular del NaHS anhidre. L'aigua d'hidratació (també anomenada aigua de cristal·lització) són les molècules d'aigua que formen l'estructura cristal·lina33. Els hidrats tenen propietats físiques i termodinàmiques diferents en comparació amb els anhidrats34.
Abans d'afegir NaHS a l'aigua potable, mesureu el pH i la temperatura del dissolvent. Aboqueu immediatament la solució de NaHS a l'ampolla d'aigua de rata/ratolí a la gàbia dels animals. Es van recollir mostres de la punta i de l'interior de l'ampolla d'aigua a les 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 12 i 24 h per mesurar el contingut de sulfur. Les mesures de sulfur es van prendre immediatament després de cada mostreig. Vam obtenir mostres de la punta del tub perquè alguns estudis han demostrat que la petita mida dels porus del tub d'aigua pot minimitzar l'evaporació de H2S15,19. Aquest problema sembla aplicar-se també a la solució de l'ampolla. Tanmateix, aquest no va ser el cas de la solució al coll de l'ampolla d'aigua, que tenia una taxa d'evaporació més alta i era autooxidant; de fet, els animals van beure aquesta aigua primer.
En l'estudi es van utilitzar rates Wistar mascles i femelles. Les rates es van allotjar en gàbies de polipropilè (2-3 rates per gàbia) en condicions estàndard (temperatura 21-26 °C, humitat 32-40%) amb 12 h de llum (de 7 a 19 h) i 12 h de foscor (de 19 a 7 h). Les rates tenien lliure accés a aigua de l'aixeta i es van alimentar amb menjar estàndard (Khorak Dam Pars Company, Teheran, Iran). Les rates Wistar femelles (n = 10, pes corporal: 190-230 g) i mascles (n = 10, pes corporal: 320-370 g) de la mateixa edat (6 mesos) es van dividir aleatòriament en grups de control i tractats amb NaHS (30 μM) (n = 5 per grup). Per determinar la mida de la mostra, vam utilitzar l'enfocament KISS (Keep It Simple, Stupid), que combina experiència prèvia i anàlisi de potència35. Primer vam dur a terme un estudi pilot en 3 rates i vam determinar el nivell total mitjà de sulfur en el sèrum i la desviació estàndard (8,1 ± 0,81 μM). Després, considerant una potència del 80% i assumint un nivell de significació bilateral del 5%, vam determinar una mida de mostra preliminar (n = 5 segons la literatura prèvia) que corresponia a una mida d'efecte estandarditzada de 2,02 amb el valor predefinit suggerit per Festing per calcular la mida de la mostra d'animals d'experimentació35. Després de multiplicar aquest valor per la desviació estàndard (2,02 × 0,81), la mida d'efecte detectable prevista (1,6 μM) va ser del 20%, cosa que és acceptable. Això significa que n = 5/grup és suficient per detectar un canvi mitjà del 20% entre els grups. Les rates es van dividir aleatòriament en grups de control i tractats amb NaSH mitjançant la funció aleatòria del programari Excel36 (Figura suplementària 1). Es va realitzar un cegament a nivell de resultat i els investigadors que van realitzar les mesures bioquímiques no coneixien les assignacions de grups.
Els grups de NaHS d'ambdós sexes van ser tractats amb una solució de NaHS de 30 μM preparada en aigua potable durant 2 setmanes; es va subministrar una solució fresca cada 24 h, durant les quals es va mesurar el pes corporal. Es van recollir mostres de sang de les puntes de la cua de totes les rates sota anestèsia amb isoflurà cada dos dies al final de la primera i la segona setmana. Les mostres de sang es van centrifugar a 3000 g durant 10 min, es va separar el sèrum i es va emmagatzemar a –80 °C per a la posterior mesura de la urea sèrica, la creatinina (Cr) i el sulfur total. La urea sèrica es va determinar mitjançant el mètode enzimàtic de la ureasa i la creatinina sèrica es va determinar mitjançant el mètode fotomètric de Jaffe utilitzant kits disponibles comercialment (Man Company, Teheran, Iran) i un analitzador automàtic (Selectra E, número de sèrie 0-2124, Països Baixos). Els coeficients de variació intra i interassaig per a la urea i el Cr van ser inferiors al 2,5%.
El mètode del blau de metilè (MB) s'utilitza per mesurar el sulfur total en aigua potable i sèrum que conté NaHS; el MB és el mètode més utilitzat per mesurar el sulfur en solucions a granel i mostres biològiques11,37. El mètode MB es pot utilitzar per estimar el conjunt total de sulfurs38 i mesurar sulfurs inorgànics en forma de H2S, HS- i S2 en la fase aquosa39. En aquest mètode, el sofre es precipita com a sulfur de zinc (ZnS) en presència d'acetat de zinc11,38. La precipitació amb acetat de zinc és el mètode més utilitzat per separar els sulfurs d'altres cromòfors11. El ZnS es va redissoldre utilitzant HCl11 en condicions fortament àcides. El sulfur reacciona amb el DMPD en una proporció estequiomètrica d'1:2 en una reacció catalitzada per clorur fèrric (el Fe3+ actua com a agent oxidant) per formar el colorant MB, que es detecta espectrofotomètricament a 670 nm40,41. El límit de detecció del mètode MB és d'aproximadament 1 μM11.
En aquest estudi, es van afegir 100 μL de cada mostra (solució o sèrum) a un tub; després es van afegir 200 μL d'acetat de zinc (1% p/v en aigua destil·lada), 100 μL de DMPD (20 mM en HCl 7,2 M) i 133 μL de FeCl3 (30 mM en HCl 1,2 M). La mescla es va incubar a 37 °C a les fosques durant 30 min. La solució es va centrifugar a 10.000 g durant 10 min i l'absorbància del sobrenedant es va llegir a 670 nm mitjançant un lector de microplaques (BioTek, MQX2000R2, Winooski, VT, EUA). Les concentracions de sulfur es van determinar mitjançant una corba de calibratge de NaHS (0–100 μM) en ddH2O (Figura suplementària 2). Totes les solucions utilitzades per a les mesures es van preparar al moment. Els coeficients de variació intra i interassaig per als mesuraments de sulfur van ser del 2,8% i el 3,4%, respectivament. També vam determinar el sulfur total recuperat de mostres d'aigua potable i sèrum que contenien tiosulfat de sodi utilitzant el mètode de mostra fortificada42. Les recuperacions per a mostres d'aigua potable i sèrum que contenien tiosulfat de sodi van ser del 91 ± 1,1% (n = 6) i del 93 ± 2,4% (n = 6), respectivament.
L'anàlisi estadística es va dur a terme mitjançant el programari GraphPad Prism versió 8.0.2 per a Windows (GraphPad Software, San Diego, CA, EUA, www.graphpad.com). Es va utilitzar una prova t aparellada per comparar la temperatura i el pH de l'aigua potable abans i després de l'addició de NaHS. La pèrdua d'H2S a la solució que contenia NaHS es va calcular com una disminució percentual respecte a l'absorció basal, i per avaluar si la pèrdua era estadísticament significativa, vam realitzar una ANOVA de mesures repetides unidireccional seguida de la prova de comparació múltiple de Dunnett. El pes corporal, la urea sèrica, la creatinina sèrica i el sulfur sèric total al llarg del temps es van comparar entre rates de control i tractades amb NaHS de diferents sexes mitjançant una ANOVA mixta bidireccional (entre-dins) seguida d'una prova post hoc de Bonferroni. Els valors de P bilaterals < 0,05 es van considerar estadísticament significatius.
El pH de l'aigua potable era de 7,60 ± 0,01 abans de l'addició de NaHS i de 7,71 ± 0,03 després de l'addició de NaHS (n = 13, p = 0,0029). La temperatura de l'aigua potable era de 26,5 ± 0,2 i va disminuir a 26,2 ± 0,2 després de l'addició de NaHS (n = 13, p = 0,0128). Prepareu una solució de NaHS de 30 μM en aigua potable i guardeu-la en una ampolla d'aigua. La solució de NaHS és inestable i la seva concentració disminueix amb el temps. En prendre mostres del coll de l'ampolla d'aigua, es va observar una disminució significativa (68,0%) durant la primera hora, i el contingut de NaHS a la solució va disminuir un 72% i un 75% després de 12 i 24 hores, respectivament. En mostres obtingudes d'ampolles d'aigua, la reducció de NaHS no va ser significativa fins a les 2 hores, però després de 12 i 24 hores havia disminuït un 47% i un 72%, respectivament. Aquestes dades indiquen que el percentatge de NaHS en una solució de 30 μM preparada en aigua potable havia disminuït a aproximadament una quarta part del valor inicial després de 24 hores, independentment de la ubicació del mostreig (Figura 1).
Estabilitat de la solució de NaHS (30 μM) en aigua potable en ampolles de rata/ratolí. Després de la preparació de la solució, es van prendre mostres de la punta i de l'interior de l'ampolla d'aigua. Les dades es presenten com a mitjana ± SD (n = 6/grup). * i #, P < 0,05 en comparació amb el temps 0. La fotografia de l'ampolla d'aigua mostra la punta (amb l'obertura) i el cos de l'ampolla. El volum de la punta és d'aproximadament 740 μL.
La concentració de NaHS en la solució de 30 μM acabada de preparar va ser de 30,3 ± 0,4 μM (rang: 28,7–31,9 μM, n = 12). No obstant això, després de 24 h, la concentració de NaHS va disminuir a un valor inferior (mitjana: 3,0 ± 0,6 μM). Com es mostra a la Figura 2, les concentracions de NaHS a les quals van ser exposades les rates no van ser constants durant el període d'estudi.
El pes corporal de les rates femelles va augmentar significativament amb el temps (de 205,2 ± 5,2 g a 213,8 ​​± 7,0 g en el grup control i de 204,0 ± 8,6 g a 211,8 ± 7,5 g en el grup tractat amb NaHS); no obstant això, el tractament amb NaHS no va tenir cap efecte sobre el pes corporal (Fig. 3). El pes corporal de les rates mascles va augmentar significativament amb el temps (de 338,6 ± 8,3 g a 352,4 ± 6,0 g en el grup control i de 352,4 ± 5,9 g a 363,2 ± 4,3 g en el grup tractat amb NaHS); no obstant això, el tractament amb NaHS no va tenir cap efecte sobre el pes corporal (Fig. 3).
Canvis en el pes corporal en rates femelles i mascles després de l'administració de NaHS (30 μM). Les dades es presenten com a mitjana ± SEM i es van comparar mitjançant una anàlisi de la variància mixta bidireccional (dins-intermèdia) amb la prova post hoc de Bonferroni. n = 5 de cada sexe a cada grup.
Les concentracions sèriques d'urea i creatina fosfat van ser comparables en rates de control i tractades amb NaSH durant tot l'estudi. A més, el tractament amb NaSH no va afectar les concentracions sèriques d'urea i creatincrom (Taula 1).
Les concentracions sèriques totals de sulfur basals van ser comparables entre les rates mascles (8,1 ± 0,5 μM vs. 9,3 ± 0,2 μM) i femelles (9,1 ± 1,0 μM vs. 6,1 ± 1,1 μM) de control i les tractades amb NaHS. L'administració de NaHS durant 14 dies no va tenir cap efecte sobre els nivells sèrics totals de sulfur ni en rates mascles ni en femelles (Fig. 4).
Canvis en les concentracions sèriques totals de sulfur en rates mascles i femelles després de l'administració de NaHS (30 μM). Les dades es presenten com a mitjana ± SEM i es van comparar mitjançant una anàlisi de la variància mixta bidireccional (dins de dins) amb la prova post hoc de Bonferroni. Per a cada sexe, n = 5/grup.
La principal conclusió d'aquest estudi és que l'aigua potable que conté NaHS és inestable: només es pot detectar aproximadament una quarta part del contingut total inicial de sulfur 24 hores després del mostreig de la punta i de l'interior d'ampolles d'aigua de rata/ratolí. A més, les rates van ser exposades a concentracions inestables de NaHS a causa de la pèrdua d'H2S a la solució de NaHS, i l'addició de NaHS a l'aigua potable no va afectar el pes corporal, la urea sèrica i el crom de creatina, ni el sulfur sèric total.
En aquest estudi, la taxa de pèrdua d'H2S de solucions de NaHS de 30 μM preparades en aigua potable va ser d'aproximadament un 3% per hora. En una solució tamponada (100 μM de sulfur de sodi en 10 mM de PBS, pH 7,4), es va informar que la concentració de sulfur disminuïa un 7% al llarg del temps durant 8 h11. Anteriorment hem defensat l'administració intraperitoneal de NaHS informant que la taxa de pèrdua de sulfur d'una solució de NaHS de 54 μM en aigua potable era d'aproximadament un 2,3% per hora (4%/hora en les primeres 12 h i 1,4%/hora en les últimes 12 h després de la preparació)8. Estudis anteriors43 van trobar una pèrdua constant d'H2S de les solucions de NaHS, principalment a causa de la volatilització i l'oxidació. Fins i tot sense l'addició de bombolles, el sulfur de la solució stock es perd ràpidament a causa de la volatilització de l'H2S11. Els estudis han demostrat que durant el procés de dilució, que dura uns 30-60 segons, es perd aproximadament entre un 5 i un 10% d'H2S a causa de l'evaporació6. Per evitar l'evaporació de l'H2S de la solució, els investigadors han pres diverses mesures, com ara remenar suaument la solució12, cobrir la solució mare amb una pel·lícula de plàstic6 i minimitzar l'exposició de la solució a l'aire, ja que la velocitat d'evaporació de l'H2S depèn de la interfície aire-líquid.13 L'oxidació espontània de l'H2S es produeix principalment a causa dels ions de metalls de transició, especialment el ferro fèrric, que són impureses de l'aigua.13 L'oxidació de l'H2S provoca la formació de polisulfurs (àtoms de sofre units per enllaços covalents)11. Per evitar la seva oxidació, es preparen solucions que contenen H2S en dissolvents desoxigenats44,45 i després es purguen amb argó o nitrogen durant 20-30 min per garantir la desoxigenació.11,12,37,44,45,46 L'àcid dietilenetriaminpentaacètic (DTPA) és un quelant de metalls (10-4 M) que impedeix l'autooxidació de l'HS- en solucions aeròbiques. En absència de DTPA, la taxa d'autooxidació de l'HS- és d'aproximadament el 50% durant aproximadament 3 h a 25 °C37,47. A més, com que l'oxidació del sulfur 1e està catalitzada per llum ultraviolada, la solució s'ha d'emmagatzemar en gel i protegir de la llum11.
Com es mostra a la Figura 5, el NaHS es dissocia en Na+ i HS-6 quan es dissol en aigua; aquesta dissociació està determinada pel pK1 de la reacció, que depèn de la temperatura: pK1 = 3,122 + 1132/T, on T oscil·la entre 5 i 30 °C i es mesura en graus Kelvin (K), K = °C + 273,1548. L'HS- té un pK2 elevat (pK2 = 19), de manera que a pH < 96,49, no es forma S2- o es forma en quantitats molt petites. En canvi, l'HS- actua com a base i accepta H+ d'una molècula d'H2O, i l'H2O actua com a àcid i es converteix en H2S i OH-.
Formació de gas H2S dissolt en una solució de NaHS (30 µM). aq, solució aquosa; g, gas; l, líquid. Tots els càlculs assumeixen que el pH de l'aigua és de 7,0 i la temperatura de l'aigua és de 20 °C. Creat amb BioRender.com.
Malgrat l'evidència que les solucions de NaHS són inestables, diversos estudis amb animals han utilitzat solucions de NaHS en aigua potable com a compost donant d'H2S15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 amb durades d'intervenció que van des d'1 fins a 21 setmanes (Taula 2). Durant aquests estudis, la solució de NaHS es va renovar cada 12 h, 15, 17, 18, 24, 25 h o 24 h, 19, 20, 21, 22, 23 h. Els nostres resultats van mostrar que les rates estaven exposades a concentracions inestables de fàrmac a causa de la pèrdua d'H2S de la solució de NaHS, i el contingut de NaHS a l'aigua potable de les rates va fluctuar significativament durant 12 o 24 h (vegeu la Figura 2). Dos d'aquests estudis van informar que els nivells d'H2S a l'aigua es van mantenir estables durant 24 h22 o que només es van observar pèrdues d'H2S del 2-3% durant 12 h15, però no van proporcionar dades ni detalls de mesurament que ho acreditessin. Dos estudis han demostrat que el diàmetre petit de les ampolles d'aigua pot minimitzar l'evaporació d'H2S15,19. Tanmateix, els nostres resultats van mostrar que això només pot retardar la pèrdua d'H2S d'una ampolla d'aigua 2 h en lloc de 12-24 h. Ambdós estudis assenyalen que suposem que el nivell de NaHS a l'aigua potable no va canviar perquè no vam observar un canvi de color a l'aigua; per tant, l'oxidació de l'H2S per l'aire no va ser significativa19,20. Sorprenentment, aquest mètode subjectiu avalua l'estabilitat del NaHS a l'aigua en lloc de mesurar el canvi en la seva concentració al llarg del temps.
La pèrdua d'H2S en una solució de NaHS està relacionada amb el pH i la temperatura. Com s'ha assenyalat al nostre estudi, la dissolució de NaHS en aigua provoca la formació d'una solució alcalina50. Quan el NaHS es dissol en aigua, la formació de gas H2S dissolt depèn del valor del pH6. Com més baix sigui el pH de la solució, més gran serà la proporció de NaHS present com a molècules de gas H2S i més sulfur es perdrà de la solució aquosa11. Cap d'aquests estudis va informar del pH de l'aigua potable utilitzada com a dissolvent per al NaHS. Segons les recomanacions de l'OMS, que adopten la majoria dels països, el pH de l'aigua potable hauria d'estar entre 6,5 i 8,551. En aquest rang de pH, la taxa d'oxidació espontània de l'H2S augmenta aproximadament deu vegades13. La dissolució de NaHS en aigua en aquest rang de pH donarà lloc a una concentració de gas H2S dissolt d'1 a 22,5 μM, cosa que emfatitza la importància de controlar el pH de l'aigua abans de dissoldre el NaHS. A més, el rang de temperatura indicat a l'estudi anterior (18–26 °C) provocaria un canvi en la concentració de gas H2S dissolt a la solució d'aproximadament el 10%, ja que els canvis de temperatura alteren el pK1, i petits canvis en el pK1 poden tenir un impacte significatiu en la concentració de gas H2S dissolt48. A més, la llarga durada d'alguns estudis (5 mesos)22, durant els quals s'espera una gran variabilitat de temperatura, també agreuja aquest problema.
Tots els estudis excepte un21 van utilitzar una solució de NaHS de 30 μM en aigua potable. Per explicar la dosi utilitzada (és a dir, 30 μM), alguns autors van assenyalar que el NaHS en fase aquosa produeix exactament la mateixa concentració de gas H2S i que el rang fisiològic de l'H2S és de 10 a 100 μM, de manera que aquesta dosi està dins del rang fisiològic15,16. Altres van explicar que 30 μM de NaHS pot mantenir el nivell plasmàtic d'H2S dins del rang fisiològic, és a dir, 5-300 μM19,20. Considerem la concentració de NaHS en aigua de 30 μM (pH = 7,0, T = 20 °C), que es va utilitzar en alguns estudis per estudiar els efectes de l'H2S. Podem calcular que la concentració de gas H2S dissolt és de 14,7 μM, que és aproximadament el 50% de la concentració inicial de NaHS. Aquest valor és similar al valor calculat per altres autors en les mateixes condicions13,48.
En el nostre estudi, l'administració de NaHS no va canviar el pes corporal; aquest resultat és coherent amb els resultats d'altres estudis en ratolins mascles22,23 i rates mascles18; Tanmateix, dos estudis van informar que el NaSH va restaurar la disminució del pes corporal en rates nefrectomitzades24,26, mentre que altres estudis no van informar de l'efecte de l'administració de NaSH sobre el pes corporal15,16,17,19,20,21,25. A més, en el nostre estudi, l'administració de NaSH no va afectar els nivells sèrics d'urea i creatina-crom, la qual cosa és coherent amb els resultats d'un altre informe25.
L'estudi va trobar que l'addició de NaHS a l'aigua potable durant 2 setmanes no va afectar les concentracions totals de sulfur sèric en rates mascles i femelles. Aquesta troballa és coherent amb els resultats de Sen et al. (16): 8 setmanes de tractament amb 30 μM de NaHS a l'aigua potable no van afectar els nivells plasmàtics de sulfur en rates de control; no obstant això, van informar que aquesta intervenció va restaurar la disminució dels nivells d'H2S al plasma de ratolins nefrectomitzats. Li et al. (22) també van informar que el tractament amb 30 μM de NaHS a l'aigua potable durant 5 mesos va augmentar els nivells plasmàtics de sulfur lliure en ratolins envellits en aproximadament un 26%. Altres estudis no han informat de canvis en el sulfur circulant després de l'addició de NaHS a l'aigua potable.
Set estudis van informar de l'ús de Sigma NaHS15,16,19,20,21,22,23 però no van proporcionar més detalls sobre l'aigua d'hidratació, i cinc estudis no van esmentar la font de NaHS utilitzada en els seus mètodes de preparació17,18,24,25,26. El NaHS és una molècula hidratada i el seu contingut d'aigua d'hidratació pot variar, cosa que afecta la quantitat de NaHS necessària per preparar una solució d'una molaritat determinada. Per exemple, el contingut de NaHS en el nostre estudi era de NaHS•1.3 H2O. Per tant, les concentracions reals de NaHS en aquests estudis poden ser inferiors a les informades.
«Com pot un compost de vida tan curta tenir un efecte tan durador?» Pozgay et al.21 van fer aquesta pregunta en avaluar els efectes del NaHS sobre la colitis en ratolins. Esperen que els estudis futurs puguin respondre a aquesta pregunta i especular que les solucions de NaHS poden contenir polisulfurs més estables a més de l'H2S i els disulfurs que intervenen en l'efecte del NaHS21. Una altra possibilitat és que concentracions molt baixes de NaHS que queden en solució també puguin tenir un efecte beneficiós. De fet, Olson et al. van proporcionar proves que els nivells micromolars d'H2S a la sang no són fisiològics i haurien d'estar en el rang nanomolar o ser completament absents13. L'H2S pot actuar a través de la sulfatació de proteïnes, una modificació posttraduccional reversible que afecta la funció, l'estabilitat i la localització de moltes proteïnes52,53,54. De fet, en condicions fisiològiques, aproximadament entre el 10% i el 25% de moltes proteïnes hepàtiques estan sulfilades53. Ambdós estudis reconeixen la ràpida destrucció de NaHS19,23 però, sorprenentment, afirmen que «vam controlar la concentració de NaHS a l'aigua potable substituint-lo diàriament».23 Un estudi va afirmar accidentalment que «el NaHS és un donant estàndard d'H2S i s'utilitza habitualment en la pràctica clínica per substituir el propi H2S».18
La discussió anterior mostra que el NaHS es perd de la solució a través de la volatilització, l'oxidació i la fotòlisi, i per tant es fan alguns suggeriments per reduir la pèrdua d'H2S de la solució. En primer lloc, l'evaporació de l'H2S depèn de la interfície gas-líquid13 i del pH de la solució11; per tant, per minimitzar la pèrdua per evaporació, el coll de l'ampolla d'aigua es pot fer tan petit com sigui possible, tal com s'ha descrit anteriorment15,19, i el pH de l'aigua es pot ajustar a un límit superior acceptable (és a dir, 6,5–8,551) per minimitzar la pèrdua per evaporació11. En segon lloc, l'oxidació espontània de l'H2S es produeix a causa dels efectes de l'oxigen i la presència d'ions metàl·lics de transició a l'aigua potable13, de manera que la desoxigenació de l'aigua potable amb argó o nitrogen44,45 i l'ús de quelants metàl·lics37,47 poden reduir l'oxidació dels sulfurs. En tercer lloc, per evitar la fotodescomposició de l'H2S, les ampolles d'aigua es poden embolicar amb paper d'alumini; Aquesta pràctica també s'aplica a materials sensibles a la llum com l'estreptozotocina55. Finalment, les sals de sulfur inorgàniques (NaHS, Na2S i CaS) es poden administrar per sonda en lloc de dissoldre-les en aigua potable, tal com s'ha informat anteriorment56,57,58; els estudis han demostrat que el sulfur de sodi radioactiu administrat per sonda a rates s'absorbeix bé i es distribueix a pràcticament tots els teixits59. Fins ara, la majoria dels estudis han administrat sals de sulfur inorgàniques per via intraperitoneal; tanmateix, aquesta via s'utilitza rarament en entorns clínics60. D'altra banda, la via oral és la via d'administració més comuna i preferida en humans61. Per tant, recomanem avaluar els efectes dels donants d'H2S en rosegadors mitjançant sonda oral.
Una limitació és que vam mesurar el sulfur en solució aquosa i sèrum utilitzant el mètode MB. Els mètodes per mesurar el sulfur inclouen la titració de iode, l'espectrofotometria, el mètode electroquímic (potenciometria, amperometria, mètode culomètric i mètode amperomètric) i la cromatografia (cromatografia de gasos i cromatografia líquida d'alta resolució), entre els quals el mètode més utilitzat és el mètode espectrofotomètric MB62. Una limitació del mètode MB per mesurar H2S en mostres biològiques és que mesura tots els compostos que contenen sofre i no l'H2S63 lliure perquè es realitza en condicions àcides, cosa que resulta en l'extracció de sofre de la font biològica64. Tanmateix, segons l'Associació Americana de Salut Pública, MB és el mètode estàndard per mesurar el sulfur en aigua65. Per tant, aquesta limitació no afecta els nostres principals resultats sobre la inestabilitat de les solucions que contenen NaHS. A més, en el nostre estudi, la recuperació de les mesures de sulfur en mostres d'aigua i sèrum que contenen NaHS va ser del 91% i el 93%, respectivament. Aquests valors estan en línia amb els rangs reportats anteriorment (77-92)66, cosa que indica una precisió analítica acceptable42. Val a dir que vam utilitzar rates mascles i femelles d'acord amb les directrius dels Instituts Nacionals de Salut (NIH) per evitar una dependència excessiva d'estudis només amb animals mascles en estudis preclínics67 i per incloure rates mascles i femelles sempre que fos possible68. Aquest punt ha estat emfatitzat per altres69,70,71.
En conclusió, els resultats d'aquest estudi indiquen que les solucions de NaHS preparades a partir d'aigua potable no es poden utilitzar per generar H2S a causa de la seva inestabilitat. Aquesta via d'administració exposaria els animals a nivells de NaHS inestables i inferiors a l'esperat; per tant, els resultats poden no ser aplicables als humans.
Els conjunts de dades utilitzats i/o analitzats durant l'estudi actual estan disponibles a través de l'autor corresponent si es sol·licita raonablement.
Szabo, K. Cronologia de la recerca del sulfur d'hidrogen (H2S): de la toxina ambiental al mediador biològic. Biochemistry and Pharmacology 149, 5–19. https://doi.org/10.1016/j.bcp.2017.09.010 (2018).
Abe, K. i Kimura, H. Possible paper del sulfur d'hidrogen com a neuromodulador endogen. Journal of Neuroscience, 16, 1066–1071. https://doi.org/10.1523/JNEUROSCI.16-03-01066.1996 (1996).
Chirino, G., Szabo, C. i Papapetropoulos, A. Funció fisiològica del sulfur d'hidrogen en cèl·lules, teixits i òrgans de mamífers. Reviews in Physiology and Molecular Biology 103, 31–276. https://doi.org/10.1152/physrev.00028.2021 (2023).
Dillon, KM, Carrazzone, RJ, Matson, JB i Kashfi, K. La promesa en evolució dels sistemes d'administració cel·lular d'òxid nítric i sulfur d'hidrogen: una nova era de la medicina personalitzada. Biochemistry and Pharmacology 176, 113931. https://doi.org/10.1016/j.bcp.2020.113931 (2020).
Sun, X., et al. L'administració a llarg termini d'un donant de sulfur d'hidrogen d'alliberament lent pot prevenir lesions per isquèmia/reperfusió miocardíaca. Scientific reports 7, 3541. https://doi.org/10.1038/s41598-017-03941-0 (2017).
Sitdikova, GF, Fuchs, R., Kainz, W., Weiger, TM i Hermann, A. La fosforilació del canal BK regula la sensibilitat al sulfur d'hidrogen (H2S). Frontiers in Physiology 5, 431. https://doi.org/10.3389/fphys.2014.00431 (2014).
Sitdikova, GF, Weiger, TM i Hermann, A. El sulfur d'hidrogen millora l'activitat del canal de potassi activat per calci (BK) en cèl·lules tumorals hipofisàries de rata. Archit. Pfluegers. 459, 389–397. https://doi.org/10.1007/s00424-009-0737-0 (2010).
Jeddy, S., et al. El sulfur d'hidrogen millora l'efecte protector del nitrit contra la lesió per isquèmia-reperfusió miocardíaca en rates diabètiques tipus 2. Òxid nítric 124, 15–23. https://doi.org/10.1016/j.niox.2022.04.004 (2022).
Corvino, A., et al. Tendències en la química dels donants d'H2S i el seu impacte en les malalties cardiovasculars. Antioxidants 10, 429. https://doi.org/10.3390/antiox10030429 (2021).
DeLeon, ER, Stoy, GF i Olson, KR (2012). Pèrdues passives de sulfur d'hidrogen en experiments biològics. Analytical Biochemistry 421, 203–207. https://doi.org/10.1016/j.ab.2011.10.016 (2012).
Nagy, P., et al. Aspectes químics de les mesures de sulfur d'hidrogen en mostres fisiològiques. Biochimica et Biophysical Acta 1840, 876–891. https://doi.org/10.1016/j.bbagen.2013.05.037 (2014).
Kline, LL.D. Determinació espectrofotomètrica de sulfur d'hidrogen en aigües naturals. Limnol. Oceanogr. 14, 454–458. https://doi.org/10.4319/lo.1969.14.3.0454 (1969).
Olson, KR (2012). Formació pràctica en química i biologia del sulfur d'hidrogen. «Antioxidants». Redox Signaling. 17, 32–44. https://doi.org/10.1089/ars.2011.4401 (2012).