Anteriorment vam informar que els nivells sèrics del metabòlit del triptòfan derivat de l'intestí, l'àcid indol-3-propiònic (IPA), són més baixos en pacients amb fibrosi hepàtica. En aquest estudi, vam investigar el transcriptoma i el metiloma de l'ADN en fetges obesos en relació amb els nivells sèrics d'IPA, així com el paper de l'IPA en la inducció de la inactivació fenotípica de les cèl·lules estrellades hepàtiques (HSC) in vitro.
L'estudi va incloure 116 pacients obesos sense diabetis mellitus tipus 2 (DM2) (edat 46,8 ± 9,3 anys; IMC: 42,7 ± 5,0 kg/m²) que es van sotmetre a cirurgia bariàtrica al Centre de Cirurgia Bariàtrica de Kuopio (KOBS). Els nivells circulants d'IPA es van mesurar mitjançant cromatografia líquida-espectrometria de masses (LC-MS), l'anàlisi del transcriptoma hepàtic es va realitzar mitjançant seqüenciació d'ARN total i l'anàlisi de metilació de l'ADN es va realitzar mitjançant l'Infinium HumanMethylation450 BeadChip. Es van utilitzar cèl·lules estrellades hepàtiques humanes (LX-2) per a experiments in vitro.
Els nivells sèrics d'IPA es van correlacionar amb l'expressió de gens implicats en les vies apoptòtiques, mitofàgiques i de longevitat al fetge. El gen AKT serina/treonina quinasa 1 (AKT1) va ser el gen d'interacció més abundant i dominant en els perfils de transcripció hepàtica i metilació de l'ADN. El tractament amb IPA va induir apoptosi, va disminuir la respiració mitocondrial i va alterar la morfologia cel·lular i la dinàmica mitocondrial modulant l'expressió de gens que se sap que regulen la fibrosi, l'apoptosi i la supervivència de les cèl·lules LX-2.
En conjunt, aquestes dades donen suport a la idea que l'IPA té possibles efectes terapèutics i pot induir apoptosi i canviar el fenotip de les HSC cap a un estat inactiu, ampliant així la possibilitat d'inhibir la fibrosi hepàtica interferint amb l'activació de les HSC i el metabolisme mitocondrial.
La prevalença de l'obesitat i la síndrome metabòlica s'ha associat amb una incidència creixent de la malaltia del fetge gras associat metabòlicament (MASLD); la malaltia afecta entre el 25% i el 30% de la població general [1]. La principal conseqüència de l'etiologia de la MASLD és la fibrosi hepàtica, un procés dinàmic caracteritzat per l'acumulació contínua de matriu extracel·lular fibrosa (MEC) [2]. Les principals cèl·lules implicades en la fibrosi hepàtica són les cèl·lules estrellades hepàtiques (HSC), que presenten quatre fenotips coneguts: latents, activades, inactivades i senescents [3, 4]. Les HSC es poden activar i transdiferenciar-se d'una forma latent a cèl·lules proliferatives semblants a fibroblasts amb altes demandes energètiques, amb una major expressió d'α-actina del múscul llis (α-SMA) i col·lagen tipus I (Col-I) [5, 6]. Durant la reversió de la fibrosi hepàtica, les HSC activades s'eliminen mitjançant apoptosi o inactivació. Aquests processos inclouen la regulació a la baixa dels gens fibrogènics i la modulació dels gens de prosupervivència (com ara les vies de senyalització NF-κB i PI3K/Akt) [7, 8], així com canvis en la dinàmica i la funció mitocondrials [9].
S'ha descobert que els nivells sèrics del metabòlit del triptòfan, l'àcid indol-3-propiònic (IPA), produït a l'intestí, disminueixen en malalties metabòliques humanes, inclosa la MASLD [10-13]. L'IPA s'associa amb la ingesta de fibra dietètica, és conegut pels seus efectes antioxidants i antiinflamatoris, i atenua el fenotip d'esteatohepatitis no alcohòlica (NASH) induïda per la dieta in vivo i in vitro [11-14]. Algunes proves provenen del nostre estudi anterior, que va demostrar que els nivells sèrics d'IPA eren més baixos en pacients amb fibrosi hepàtica que en pacients obesos sense fibrosi hepàtica a l'Estudi de Cirurgia Bariàtrica de Kuopio (KOBS). A més, vam demostrar que el tractament amb IPA podria reduir l'expressió de gens que són marcadors clàssics d'adhesió cel·lular, migració cel·lular i activació de cèl·lules mare hematopoètiques en un model de cèl·lula estrellada hepàtica humana (LX-2) i és un potencial metabòlit hepatoprotector [15]. Tanmateix, encara no està clar com l'IPA indueix la regressió de la fibrosi hepàtica activant l'apoptosi de les HSC i la bioenergètica mitocondrial.
Aquí, demostrem que l'IPA sèric s'associa amb l'expressió de gens enriquits en vies d'apoptosi, mitofàgia i longevitat al fetge d'individus obesos però sense diabetis tipus 2 (KOBS). A més, hem descobert que l'IPA pot induir l'eliminació i la degradació de cèl·lules mare hematopoètiques (HSC) activades a través de la via d'inactivació. Aquests resultats revelen un nou paper per a l'IPA, convertint-lo en una diana terapèutica potencial per promoure la regressió de la fibrosi hepàtica.
Un estudi previ a la cohort KOBS va mostrar que els pacients amb fibrosi hepàtica tenien nivells circulants d'IPA més baixos en comparació amb els pacients sense fibrosi hepàtica [15]. Per excloure el possible efecte de confusió de la diabetis tipus 2, vam reclutar 116 pacients obesos sense diabetis tipus 2 (edat mitjana ± DE: 46,8 ± 9,3 anys; IMC: 42,7 ± 5,0 kg/m2) (Taula 1) de l'estudi KOBS en curs com a població d'estudi [16]. Tots els participants van donar el seu consentiment informat per escrit i el protocol de l'estudi va ser aprovat pel Comitè d'Ètica de l'Hospital del Comtat de North Savo d'acord amb la Declaració de Hèlsinki (54/2005, 104/2008 i 27/2010).
Es van obtenir mostres de biòpsia hepàtica durant la cirurgia bariàtrica i es van avaluar histològicament per patòlegs experimentats segons els criteris descrits anteriorment [17, 18]. Els criteris d'avaluació es resumeixen a la Taula Suplementària S1 i s'han descrit anteriorment [19].
Les mostres de sèrum en dejú es van analitzar mitjançant cromatografia líquida-espectrometria de masses (LC-MS) no dirigida per a l'anàlisi metabolòmica (n = 116). Les mostres es van analitzar mitjançant un sistema UHPLC-qTOF-MS (1290 LC, 6540 qTOF-MS, Agilent Technologies, Waldbronn, Karlsruhe, Alemanya) tal com s'ha descrit anteriorment19. La identificació de l'alcohol isopropílic (IPA) es va basar en el temps de retenció i la comparació de l'espectre MS/MS amb estàndards purs. La intensitat del senyal IPA (àrea del pic) es va tenir en compte en totes les anàlisis posteriors [20].
La seqüenciació d'ARN hepàtic complet es va dur a terme mitjançant Illumina HiSeq 2500 i les dades es van preprocessar tal com s'ha descrit anteriorment [19, 21, 22]. Vam realitzar una anàlisi d'expressió diferencial dirigida de transcrits que afecten la funció/biogènesi mitocondrial utilitzant 1957 gens seleccionats de la base de dades MitoMiner 4.0 [23]. L'anàlisi de metilació de l'ADN hepàtic es va realitzar mitjançant l'Infinium HumanMethylation450 BeadChip (Illumina, San Diego, CA, EUA) utilitzant la mateixa metodologia descrita anteriorment [24, 25].
El professor Stefano Romeo va proporcionar amablement cèl·lules estrellades hepàtiques humanes (LX-2) i es van cultivar i mantenir en medi DMEM/F12 (Biowest, L0093-500, 1% Pen/Strep; Lonza, DE17-602E, 2% FBS; Gibco, 10270-106). Per seleccionar la dosi de treball d'IPA, es van tractar cèl·lules LX-2 amb diferents concentracions d'IPA (10 μM, 100 μM i 1 mM; Sigma, 220027) en medi DMEM/F12 durant 24 h. A més, per investigar la capacitat de l'IPA per inactivar HSCs, es van cotractar cèl·lules LX-2 amb 5 ng/ml de TGF-β1 (sistemes R&D, 240-B-002/CF) i 1 mM d'IPA en medi sense sèrum durant 24 h. Per als controls de vehicle corresponents, es va utilitzar 4 nM de HCL que contenia 0,1% de BSA per al tractament amb TGF-β1 i es va utilitzar 0,05% de DMSO per al tractament amb IPA, i tots dos es van utilitzar junts per al tractament combinat.
L'apoptosi es va avaluar mitjançant el kit de detecció d'apoptosi FITC Annexin V amb 7-AAD (Biolegend, San Diego, CA, EUA, Cat# 640922) segons les instruccions del fabricant. Breument, es van cultivar LX-2 (1 × 105 cèl·lules/pouet) durant la nit en plaques de 12 pouets i després es van tractar amb múltiples dosis d'IPA o IPA i TGF-β1. L'endemà, es van recollir les cèl·lules flotants i adherents, es van tripsinitzar, es van rentar amb PBS, es van resuspendre en tampó d'unió a l'annexina V i es van incubar amb FITC-annexina V i 7-AAD durant 15 min.
Els mitocondris de les cèl·lules vives es van tenyir per determinar l'activitat oxidativa utilitzant Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA). Per als assaigs MTR, les cèl·lules LX-2 es van incubar a densitats iguals amb IPA i TGF-β1. Després de 24 h, les cèl·lules vives es van tripsinitzar, es van rentar amb PBS i després es van incubar amb 100 μM de MTR en un medi sense sèrum a 37 °C durant 20 min, tal com s'ha descrit anteriorment [26]. Per a l'anàlisi de la morfologia de cèl·lules vives, la mida de la cèl·lula i la complexitat citoplasmàtica es van analitzar mitjançant paràmetres de dispersió directa (FSC) i dispersió lateral (SSC), respectivament.
Totes les dades (30.000 esdeveniments) es van adquirir mitjançant NovoCyte Quanteon (Agilent) i es van analitzar amb el programari NovoExpress® 1.4.1 o FlowJo V.10.
La taxa de consum d'oxigen (OCR) i la taxa d'acidificació extracel·lular (ECAR) es van mesurar en temps real mitjançant un analitzador de flux extracel·lular Seahorse (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) equipat amb un Seahorse XF Cell Mito Stress segons les instruccions del fabricant. Breument, es van sembrar 2 × 104 cèl·lules LX-2/pouet en plaques de cultiu cel·lular XF96. Després de la incubació durant la nit, les cèl·lules es van tractar amb isopropanol (IPA) i TGF-β1 (Mètodes suplementaris 1). L'anàlisi de dades es va realitzar mitjançant el programari Seahorse XF Wave, que inclou el generador d'informes de proves de fenotip d'energia cel·lular Seahorse XF. A partir d'això, es va calcular un índex de salut bioenergètica (BHI) [27].
L'ARN total es va transcriure en ADNc. Per a mètodes específics, vegeu la referència [15]. Els nivells d'ARNm de la proteïna àcida ribosòmica P0 humana 60S (RPLP0) i de la ciclofilina A1 (PPIA) es van utilitzar com a controls gènics constitutius. El sistema de PCR en temps real QuantStudio 6 pro (Thermo Fisher, Landsmeer, Països Baixos) es va utilitzar amb el kit TaqMan™ Fast Advanced Master Mix (Applied Biosystems) o el kit Sensifast SYBR Lo-ROX (Bioline, BIO 94050), i el plegament relatiu de l'expressió gènica es va calcular utilitzant paràmetres comparatius del cicle de valor Ct (ΔΔCt) i el mètode ∆∆Ct. Els detalls dels encebadors es proporcionen a les taules suplementàries S2 i S3.
L'ADN nuclear (ADNnc) i l'ADN mitocondrial (ADNmt) es van extreure utilitzant el kit de sang i teixits DNeasy (Qiagen) tal com s'ha descrit anteriorment [28]. La quantitat relativa d'ADNmt es va calcular calculant la relació entre cada regió d'ADNmt diana i la mitjana geomètrica de les tres regions d'ADN nuclear (ADNmt/ADNnc), tal com es detalla als Mètodes suplementaris 2. Els detalls dels encebadors per a l'ADNmt i l'ADNnc es proporcionen a la Taula suplementària S4.
Les cèl·lules vives es van tenyir amb Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA) per visualitzar les xarxes mitocondrials intercel·lulars i intracel·lulars. Les cèl·lules LX-2 (1 × 104 cèl·lules/pouet) es van cultivar en portaobjectes de vidre en plaques de cultiu amb fons de vidre corresponents (Ibidi GmbH, Martinsried, Alemanya). Després de 24 h, les cèl·lules LX-2 vives es van incubar amb 100 μM MTR durant 20 min a 37 °C i els nuclis cel·lulars es van tenyir amb DAPI (1 μg/ml, Sigma-Aldrich) tal com s'ha descrit anteriorment [29]. Les xarxes mitocondrials es van visualitzar mitjançant un microscopi invertit Zeiss Axio Observer (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena, Alemanya) equipat amb un mòdul confocal Zeiss LSM 800 a 37 °C en una atmosfera humidificada amb un 5% de CO2 utilitzant un objectiu de 63×NA 1.3. Vam adquirir deu imatges de la sèrie Z per a cada tipus de mostra. Cada sèrie Z conté 30 seccions, cadascuna amb un gruix de 9,86 μm. Per a cada mostra, es van adquirir imatges de deu camps de visió diferents mitjançant el programari ZEN 2009 (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena, Alemanya), i es va realitzar una anàlisi de la morfologia mitocondrial mitjançant el programari ImageJ (v1.54d) [30, 31] d'acord amb els paràmetres detallats als Mètodes Suplementaris 3.
Les cèl·lules es van fixar amb glutaraldehid al 2% en tampó fosfat 0,1 M, seguit d'una fixació amb una solució de tetròxid d'osmi a l'1% (Sigma Aldrich, MO, EUA), es van deshidratar gradualment amb acetona (Merck, Darmstadt, Alemanya) i finalment es van incloure en resina epoxi. Es van preparar seccions ultrafines i es van tenyir amb acetat d'uranil a l'1% (Merck, Darmstadt, Alemanya) i citrat de plom a l'1% (Merck, Darmstadt, Alemanya). Les imatges ultraestructurals es van obtenir mitjançant un microscopi electrònic de transmissió JEM 2100F EXII (JEOL Ltd, Tòquio, Japó) a una tensió d'acceleració de 80 kV.
La morfologia de les cèl·lules LX-2 tractades amb IPA durant 24 h es va analitzar mitjançant microscòpia de contrast de fase a un augment de 50x utilitzant un microscopi de llum invertida Zeiss (Zeiss Axio Vert.A1 i AxioCam MRm, Jena, Alemanya).
Les dades clíniques es van expressar com a mitjana ± desviació estàndard o mediana (rang interquartílic: IQR). Es va utilitzar una anàlisi de la variància unidireccional (variables contínues) o una prova de χ² (variables categòriques) per comparar les diferències entre els tres grups d'estudi. La taxa de falsos positius (FDR) es va utilitzar per corregir les proves múltiples, i els gens amb FDR < 0,05 es van considerar estadísticament significatius. Es va utilitzar l'anàlisi de correlació de Spearman per correlacionar la metilació de l'ADN CpG amb la intensitat del senyal IPA, amb valors p nominals (p < 0,05) reportats.
L'anàlisi de vies genètiques es va dur a terme mitjançant una eina d'anàlisi de conjunts de gens basada en web (WebGestalt) per a 268 transcrits (p nominal < 0,01), 119 transcrits associats a mitocondris (p nominal < 0,05) i 4350 CpG de 3093 transcrits hepàtics que estaven associats amb els nivells circulants d'IPA en el sèrum. L'eina Venny DB (versió 2.1.0) disponible gratuïtament es va utilitzar per trobar gens superposats, i StringDB (versió 11.5) es va utilitzar per visualitzar les interaccions proteïna-proteïna.
Per a l'experiment LX-2, les mostres es van provar per a la seva normalitat mitjançant la prova de D'Agostino-Pearson. Les dades es van obtenir d'almenys tres rèpliques biològiques i es van sotmetre a ANOVA unidireccional amb la prova post hoc de Bonferroni. Es va considerar estadísticament significatiu un valor p inferior a 0,05. Les dades es presenten com a mitjana ± SD, i el nombre d'experiments s'indica a cada figura. Totes les anàlisis i gràfics es van realitzar mitjançant el programari estadístic GraphPad Prism 8 per a Windows (GraphPad Software Inc., versió 8.4.3, San Diego, EUA).
Primer, vam investigar l'associació dels nivells sèrics d'IPA amb transcrits de fetge, cos sencer i mitocondrials. En el perfil de transcrits total, el gen més fort associat amb els nivells sèrics d'IPA va ser MAPKAPK3 (FDR = 0,0077; proteïna quinasa activada per mitògens 3); en el perfil de transcrits relacionat amb els mitocondris, el gen associat més fort va ser AKT1 (FDR = 0,7621; AKT serina/treonina quinasa 1) (Fitxer addicional 1 i Fitxer addicional 2).
A continuació, vam analitzar els transcrits globals (n = 268; p < 0,01) i els transcrits associats als mitocondris (n = 119; p < 0,05), i finalment vam identificar l'apoptosi com la via canònica més significativa (p = 0,0089). Per als transcrits mitocondrials associats amb els nivells sèrics d'IPA, ens vam centrar en l'apoptosi (FDR = 0,00001), la mitofàgia (FDR = 0,00029) i les vies de senyalització del TNF (FDR = 0,000006) (Figura 1A, Taula 2 i Figures suplementàries 1A-B).
Anàlisi superposada de transcrits globals associats a mitocondris i metilació de l'ADN en fetge humà en associació amb els nivells sèrics d'IPA. A representa 268 transcrits globals, 119 transcrits associats a mitocondris i transcrits d'ADN metilats que es mapegen a 3092 llocs CpG associats amb els nivells sèrics d'IPA (valors p < 0,01 per a transcrits globals i ADN metilat, i valors p < 0,05 per a transcrits mitocondrials). Els principals transcrits superposats es mostren al mig (AKT1 i YKT6). B El mapa d'interacció dels 13 gens amb la puntuació d'interacció més alta (0,900) amb altres gens es va construir a partir dels 56 gens superposats (regió de línia negra) que es van associar significativament amb els nivells sèrics d'IPA mitjançant l'eina en línia StringDB. Verd: Gens mapejats al component cel·lular de Gene Ontology (GO): mitocondris (GO:0005739). AKT1 és la proteïna amb la puntuació més alta (0,900) per a les interaccions amb altres proteïnes basades en les dades (basades en mineria de text, experiments, bases de dades i coexpressió). Els nodes de la xarxa representen proteïnes i les vores representen connexions entre proteïnes.
Com que els metabòlits de la microbiota intestinal poden regular la composició epigenètica a través de la metilació de l'ADN [32], vam investigar si els nivells sèrics d'IPA estaven associats amb la metilació de l'ADN hepàtic. Vam trobar que els dos llocs principals de metilació associats amb els nivells sèrics d'IPA es trobaven a prop de la regió 3 rica en prolina-serina (C19orf55) i del membre 6 (petit) de la família de proteïnes de xoc tèrmic B (HSPB6) (Fitxer addicional 3). La metilació de l'ADN de 4350 CpG (p < 0,01) es va correlacionar amb els nivells sèrics d'IPA i es va enriquir en vies reguladores de la longevitat (p = 0,006) (Figura 1A, Taula 2 i Figura Suplementària 1C).
Per entendre els mecanismes biològics subjacents a les associacions entre els nivells sèrics d'IPA, les transcripcions globals, les transcripcions associades a mitocondris i la metilació de l'ADN en el fetge humà, vam realitzar una anàlisi de superposició dels gens identificats a l'anàlisi de vies anterior (Figura 1A). Els resultats de l'anàlisi d'enriquiment de vies dels 56 gens superposats (dins de la línia negra a la Figura 1A) van mostrar que la via d'apoptosi (p = 0,00029) va destacar dos gens comuns a les tres anàlisis: AKT1 i YKT6 (homòleg YKT6 v-SNARE), tal com es mostra al diagrama de Venn (Figura suplementària 2 i Figura 1A). Curiosament, vam trobar que AKT1 (cg19831386) i YKT6 (cg24161647) estaven correlacionats positivament amb els nivells sèrics d'IPA (Fitxer addicional 3). Per identificar possibles interaccions proteiques entre productes gènics, vam seleccionar 13 gens amb la puntuació de regió comuna més alta (0,900) entre 56 gens superposats com a entrada i vam construir un mapa d'interacció. Segons el nivell de confiança (confiança marginal), el gen AKT1 amb la puntuació més alta (0,900) es trobava al capdamunt (Figura 1B).
Basant-nos en l'anàlisi de la via, vam descobrir que l'apoptosi era la via principal, per la qual cosa vam investigar si el tractament amb IPA afectaria l'apoptosi de les HSC in vitro. Anteriorment vam demostrar que diferents dosis d'IPA (10 μM, 100 μM i 1 mM) no eren tòxiques per a les cèl·lules LX-2 [15]. Aquest estudi va mostrar que el tractament amb IPA a 10 μM i 100 μM va augmentar el nombre de cèl·lules viables i necròtiques. Tanmateix, en comparació amb el grup de control, la viabilitat cel·lular va disminuir a una concentració d'IPA d'1 mM, mentre que la taxa de necrosi cel·lular es va mantenir sense canvis (Figura 2A, B). A continuació, per trobar la concentració òptima per induir l'apoptosi en cèl·lules LX-2, vam provar 10 μM, 100 μM i 1 mM d'IPA durant 24 h (Figura 2A-E i Figura Suplementària 3A-B). Curiosament, l'IPA 10 μM i 100 μM van disminuir la taxa d'apoptosi (%), però l'IPA 1 mM va augmentar l'apoptosi tardana i la taxa d'apoptosi (%) en comparació amb el control i, per tant, es va escollir per a experiments posteriors (Figures 2A-D).
L'IPA indueix l'apoptosi de les cèl·lules LX-2. Es va utilitzar el mètode de doble tinció amb annexina V i 7-AAD per quantificar la taxa d'apoptosi i la morfologia cel·lular mitjançant citometria de flux. Les cèl·lules BA es van incubar amb 10 μM, 100 μM i 1 mM d'IPA durant 24 h o amb F–H TGF-β1 (5 ng/ml) i 1 mM d'IPA en un medi sense sèrum durant 24 h. A: cèl·lules vives (annexina V -/ 7AAD-); B: cèl·lules necròtiques (annexina V -/ 7AAD+); C, F: primerenca (annexina V +/ 7AAD-); D, G: tardana (annexina V+/7AAD.+); E, H: percentatge de cèl·lules apoptòtiques primerenques i tardanes totals en taxa d'apoptosi (%). Les dades s'expressen com a mitjana ± SD, n = 3 experiments independents. Les comparacions estadístiques es van realitzar mitjançant ANOVA unidireccional amb la prova post hoc de Bonferroni. *p < 0,05; ****p < 0,0001
Com hem demostrat anteriorment, 5 ng/ml de TGF-β1 poden induir l'activació de HSC augmentant l'expressió de gens marcadors clàssics [15]. Les cèl·lules LX-2 es van tractar amb 5 ng/ml de TGF-β1 i 1 mM d'IPA en combinació (Fig. 2E-H). El tractament amb TGF-β1 no va canviar la taxa d'apoptosi, però el cotractament amb IPA va augmentar l'apoptosi tardana i la taxa d'apoptosi (%) en comparació amb el tractament amb TGF-β1 (Fig. 2E-H). Aquests resultats indiquen que 1 mM d'IPA pot promoure l'apoptosi en cèl·lules LX-2 independentment de la inducció de TGF-β1.
Vam investigar més a fons l'efecte de l'IPA sobre la respiració mitocondrial en cèl·lules LX-2. Els resultats van mostrar que 1 mM d'IPA va disminuir els paràmetres de la taxa de consum d'oxigen (OCR): respiració no mitocondrial, respiració basal i màxima, fuita de protons i producció d'ATP en comparació amb el grup de control (Figura 3A, B), mentre que l'índex de salut bioenergètica (BHI) no va canviar.
L'IPA redueix la respiració mitocondrial en cèl·lules LX-2. La corba de respiració mitocondrial (OCR) es presenta com a paràmetres de respiració mitocondrial (respiració no mitocondrial, respiració basal, respiració màxima, fuita de protons, generació d'ATP, SRC i BHI). Les cèl·lules A i B es van incubar amb 10 μM, 100 μM i 1 mM d'IPA durant 24 h, respectivament. Les cèl·lules C i D es van incubar amb TGF-β1 (5 ng/ml) i 1 mM d'IPA en un medi sense sèrum durant 24 h, respectivament. Totes les mesures es van normalitzar al contingut d'ADN mitjançant el kit CyQuant. BHI: índex de salut bioenergètica; SRC: capacitat de reserva respiratòria; OCR: taxa de consum d'oxigen. Les dades es presenten com a mitjana ± desviació estàndard (SD), n = 5 experiments independents. Les comparacions estadístiques es van realitzar mitjançant ANOVA unidireccional i la prova post hoc de Bonferroni. *p < 0,05; **p < 0,01; i ***p < 0,001
Per obtenir una comprensió més completa de l'efecte de l'IPA sobre el perfil bioenergètic de les cèl·lules LX-2 activades per TGF-β1, vam analitzar la fosforilació oxidativa mitocondrial mitjançant OCR (Fig. 3C, D). Els resultats van mostrar que el tractament amb TGF-β1 podia reduir la respiració màxima, la capacitat de reserva respiratòria (SRC) i l'IBH en comparació amb el grup de control (Fig. 3C, D). A més, el tractament combinat va disminuir la respiració basal, la fuita de protons i la producció d'ATP, però l'SRC i l'IBH van ser significativament més alts que els tractats amb TGF-β1 (Fig. 3C, D).
També vam realitzar el "Cellular Energy Phenotype Test" proporcionat pel programari Seahorse (Fig. suplementària 4A-D). Com es mostra a la Fig. suplementària 3B, els potencials metabòlics tant d'OCR com d'ECAR van disminuir després del tractament amb TGF-β1, però no es va observar cap diferència en els grups de tractament combinat i IPA en comparació amb el grup de control. A més, tant els nivells basals com els d'estrès d'OCR van disminuir després del tractament combinat i IPA en comparació amb el grup de control (Fig. suplementària 4C). Curiosament, es va observar un patró similar amb la teràpia combinada, on no es va observar cap canvi en els nivells basals i d'estrès d'ECAR en comparació amb el tractament amb TGF-β1 (Fig. suplementària 4C). En les HSC, la reducció de la fosforilació oxidativa mitocondrial i la capacitat del tractament combinat per restaurar SCR i BHI després de l'exposició al tractament amb TGF-β1 no van alterar el potencial metabòlic (OCR i ECAR). En conjunt, aquests resultats indiquen que l'IPA pot reduir la bioenergètica en les HSC, cosa que suggereix que l'IPA pot induir un perfil energètic més baix que desplaça el fenotip HSC cap a la inactivació (Figura suplementària 4D).
L'efecte de l'IPA sobre la dinàmica mitocondrial es va investigar mitjançant la quantificació tridimensional de la morfologia mitocondrial i les connexions de xarxa, així com la tinció MTR (Figura 4 i Figura Suplementària 5). La Figura 4 mostra que, en comparació amb el grup de control, el tractament amb TGF-β1 va disminuir la superfície mitjana, el nombre de branques, la longitud total de les branques i el nombre d'unions de branques (Figura 4A i B) i va canviar la proporció de mitocondris de morfologia esfèrica a intermèdia (Figura 4C). Només el tractament amb IPA va disminuir el volum mitocondrial mitjà i va canviar la proporció de mitocondris de morfologia esfèrica a intermèdia en comparació amb el grup de control (Figura 4A). En canvi, l'esfericitat, la longitud mitjana de les branques i l'activitat mitocondrial avaluades mitjançant MTR dependent del potencial de la membrana mitocondrial (Figura 4A i E) es van mantenir sense canvis i aquests paràmetres no van diferir entre els grups. En conjunt, aquests resultats suggereixen que el tractament amb TGF-β1 i IPA sembla modular la forma i la mida mitocondrial, així com la complexitat de la xarxa en cèl·lules LX-2 vives.
L'IPA altera la dinàmica mitocondrial i l'abundància d'ADN mitocondrial en cèl·lules LX-2. A. Imatges confocals representatives de cèl·lules LX-2 vives incubades amb TGF-β1 (5 ng/ml) i 1 mM d'IPA durant 24 h en un medi sense sèrum que mostren les xarxes mitocondrials tenyides amb Mitotracker™ Red CMXRos i els nuclis tenyits de blau amb DAPI. Totes les dades contenien almenys 15 imatges per grup. Vam adquirir 10 imatges de pila Z per a cada tipus de mostra. Cada seqüència de l'eix Z contenia 30 llesques, cadascuna amb un gruix de 9,86 μm. Barra d'escala: 10 μm. B. Objectes representatius (només mitocondris) identificats aplicant un llindar adaptatiu a la imatge. Es va realitzar una anàlisi quantitativa i una comparació de les connexions de xarxa morfològiques mitocondrials per a totes les cèl·lules de cada grup. C. Freqüència de les relacions de forma mitocondrial. Els valors propers a 0 indiquen formes esfèriques i els valors propers a 1 indiquen formes filamentoses. D El contingut d'ADN mitocondrial (mtDNA) es va determinar tal com es descriu a Materials i mètodes. L'anàlisi E Mitotracker™ Red CMXRos es va realitzar mitjançant citometria de flux (30.000 esdeveniments) tal com es descriu a Materials i mètodes. Les dades es presenten com a mitjana ± SD, n = 3 experiments independents. Les comparacions estadístiques es van realitzar mitjançant ANOVA unidireccional i la prova post hoc de Bonferroni. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; ****p < 0,0001
A continuació, vam analitzar el contingut d'ADNmt en cèl·lules LX-2 com a indicador del nombre mitocondrial. En comparació amb el grup de control, el contingut d'ADNmt va augmentar en el grup tractat amb TGF-β1 (Figura 4D). En comparació amb el grup tractat amb TGF-β1, el contingut d'ADNmt va disminuir en el grup de tractament combinat (Figura 4D), cosa que suggereix que l'IPA pot reduir el contingut d'ADNmt i possiblement el nombre mitocondrial, així com la respiració mitocondrial (Figura 3C). A més, l'IPA semblava reduir el contingut d'ADNmt en el tractament combinat, però no va afectar l'activitat mitocondrial mediada per MTR (Figures 4A-C).
Vam investigar l'associació de l'IPA amb els nivells d'ARNm de gens associats amb la fibrosi, l'apoptosi, la supervivència i la dinàmica mitocondrial en cèl·lules LX-2 (Figura 5A-D). En comparació amb el grup de control, el grup tractat amb TGF-β1 va mostrar una major expressió de gens com la cadena α2 de col·lagen tipus I (COL1A2), l'α-actina del múscul llis (αSMA), la metal·loproteinasa matricial 2 (MMP2), l'inhibidor tissular de la metal·loproteinasa 1 (TIMP1) i el gen similar a la dinamina 1 (DRP1), cosa que indica un augment de la fibrosi i l'activació. A més, en comparació amb el grup de control, el tractament amb TGF-β1 va reduir els nivells d'ARNm del receptor nuclear de pregnane X (PXR), la caspasa 8 (CASP8), MAPKAPK3, l'inhibidor de l'α de les cèl·lules B, el potenciador del pèptid lleuger del gen del factor nuclear κ (NFκB1A) i l'inhibidor de la subunitat β de la cinasa del factor nuclear κB (IKBKB) (Figura 5A-D). En comparació amb el tractament amb TGF-β1, el tractament combinat amb TGF-β1 i IPA va reduir l'expressió de COL1A2 i MMP2, però va augmentar els nivells d'ARNm de PXR, TIMP1, limfoma de cèl·lules B-2 (BCL-2), CASP8, NFκB1A, NFκB1-β i IKBKB. El tractament amb IPA va disminuir significativament l'expressió de MMP2, proteïna X associada a Bcl-2 (BAX), AKT1, proteïna d'atròfia òptica 1 (OPA1) i proteïna de fusió mitocondrial 2 (MFN2), mentre que l'expressió de CASP8, NFκB1A, NFκB1B i IKBKB va augmentar en comparació amb el grup de control. Tanmateix, no es va trobar cap diferència en l'expressió de la caspasa-3 (CASP3), el factor activador de la peptidasa apoptòtica 1 (APAF1), la proteïna de fusió mitocondrial 1 (MFN1) i la proteïna de fissió 1 (FIS1). En conjunt, aquests resultats suggereixen que el tractament amb IPA modula l'expressió de gens associats amb la fibrosi, l'apoptosi, la supervivència i la dinàmica mitocondrial. Les nostres dades suggereixen que el tractament amb IPA redueix la fibrosi en cèl·lules LX-2; alhora, estimula la supervivència canviant el fenotip cap a la inactivació.
L'IPA modula l'expressió dels gens de fibroblasts, apoptòtics, de viabilitat i de dinàmica mitocondrial en cèl·lules LX-2. Els histogrames mostren l'expressió de l'ARNm en relació amb el control endogen (RPLP0 o PPIA) després que les cèl·lules LX-2 fossin induïdes amb TGF-β1 i IPA en un medi sense sèrum durant 24 h. A indica fibroblasts, B indica cèl·lules apoptòtiques, C indica cèl·lules supervivents i D indica l'expressió gènica de la dinàmica mitocondrial. Les dades es presenten com a mitjana ± desviació estàndard (SD), n = 3 experiments independents. Les comparacions estadístiques es van realitzar mitjançant ANOVA unidireccional i la prova post hoc de Bonferroni. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; ****p < 0,0001
A continuació, es van avaluar els canvis en la mida cel·lular (FSC-H) i la complexitat citoplasmàtica (SSC-H) mitjançant citometria de flux (Figura 6A, B), i els canvis en la morfologia cel·lular després del tractament amb IPA es van avaluar mitjançant microscòpia electrònica de transmissió (TEM) i microscòpia de contrast de fase (Figura suplementària 6A-B). Com s'esperava, les cèl·lules del grup tractat amb TGF-β1 van augmentar de mida en comparació amb el grup de control (Figura 6A, B), mostrant l'expansió clàssica del reticle endoplasmàtic rugós (ER*) i els fagolisosomes (P), cosa que indica l'activació de les cèl·lules mare hematopoètiques (HSC) (Figura suplementària 6A). Tanmateix, en comparació amb el grup tractat amb TGF-β1, la mida cel·lular, la complexitat citoplasmàtica (Fig. 6A, B) i el contingut d'ER* van disminuir en el grup de tractament combinat de TGF-β1 i IPA (Figura suplementària 6A). A més, el tractament amb IPA va disminuir la mida cel·lular, la complexitat citoplasmàtica (Figs. 6A, B), el contingut de P i ER* (Fig. suplementària 6A) en comparació amb el grup de control. A més, el contingut de cèl·lules apoptòtiques va augmentar després de 24 h de tractament amb IPA en comparació amb el grup de control (fletxes blanques, Fig. suplementària 6B). Col·lectivament, aquests resultats suggereixen que 1 mM d'IPA pot estimular l'apoptosi de les HSC i revertir els canvis en els paràmetres morfològics cel·lulars induïts per TGF-β1, regulant així la mida i la complexitat cel·lular, que poden estar associades amb la inactivació de HSC.
L'IPA altera la mida cel·lular i la complexitat citoplasmàtica en cèl·lules LX-2. Imatges representatives de l'anàlisi per citometria de flux. L'anàlisi va utilitzar una estratègia de comporta específica per a cèl·lules LX-2: SSC-A/FSC-A per definir la població cel·lular, FSC-H/FSC-A per identificar doblets i SSC-H/FSC-H per a l'anàlisi de la mida i la complexitat cel·lular. Les cèl·lules es van incubar amb TGF-β1 (5 ng/ml) i 1 mM d'IPA en un medi sense sèrum durant 24 h. Les cèl·lules LX-2 es van distribuir en el quadrant inferior esquerre (SSC-H-/FSC-H-), el quadrant superior esquerre (SSC-H+/FSC-H-), el quadrant inferior dret (SSC-H-/FSC-H+) i el quadrant superior dret (SSC-H+/FSC-H+) per a l'anàlisi de la mida cel·lular i la complexitat citoplasmàtica. B. La morfologia cel·lular es va analitzar mitjançant citometria de flux utilitzant FSC-H (dispersió directa, mida cel·lular) i SSC-H (dispersió lateral, complexitat citoplasmàtica) (30.000 esdeveniments). Les dades es presenten com a mitjana ± SD, n = 3 experiments independents. Les comparacions estadístiques es van realitzar mitjançant ANOVA unidireccional i la prova post hoc de Bonferroni. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001 i ****p < 0,0001
Els metabòlits intestinals com l'IPA s'han convertit en un tema candent de recerca, cosa que suggereix que es poden descobrir noves dianes a la microbiota intestinal. Per tant, és interessant que l'IPA, un metabòlit que hem relacionat amb la fibrosi hepàtica en humans [15], hagi demostrat ser un possible compost antifibròtic en models animals [13, 14]. Aquí, demostrem per primera vegada una associació entre l'IPA sèric i la transcriptòmica hepàtica global i la metilació de l'ADN en individus obesos sense diabetis tipus 2 (DM2), destacant l'apoptosi, la mitofàgia i la longevitat, així com un possible gen candidat AKT1 que regula l'homeòstasi hepàtica. Una altra novetat del nostre estudi és que hem demostrat la interacció del tractament amb IPA amb l'apoptosi, la morfologia cel·lular, la bioenergètica mitocondrial i la dinàmica en cèl·lules LX-2, cosa que indica un espectre d'energia més baix que desplaça el fenotip HSC cap a la inactivació, convertint l'IPA en un candidat potencial per millorar la fibrosi hepàtica.
Vam descobrir que l'apoptosi, la mitofàgia i la longevitat eren les vies canòniques més importants enriquides en gens hepàtics associats amb l'IPA sèric circulant. La interrupció del sistema de control de qualitat mitocondrial (MQC) pot conduir a una disfunció mitocondrial, mitofàgia i apoptosi, promovent així l'aparició de MASLD [33, 34]. Per tant, podem especular que l'IPA pot estar implicat en el manteniment de la dinàmica cel·lular i la integritat mitocondrial a través de l'apoptosi, la mitofàgia i la longevitat al fetge. Les nostres dades van mostrar que dos gens eren comuns en els tres assaigs: YKT6 i AKT1. Val la pena assenyalar que YKT6 és una proteïna SNARE implicada en el procés de fusió de la membrana cel·lular. Té un paper en l'autofàgia i la mitofàgia formant un complex d'iniciació amb STX17 i SNAP29 a l'autofagosoma, promovent així la fusió d'autofagosomes i lisosomes [35]. A més, la pèrdua de la funció de YKT6 provoca una mitofàgia deteriorada [36], mentre que la sobreexpressió de YKT6 s'associa amb la progressió del carcinoma hepatocel·lular (HCC), mostrant una major supervivència cel·lular [37]. D'altra banda, AKT1 és el gen que interactua més important i juga un paper important en les malalties hepàtiques, incloent-hi la via de senyalització PI3K/AKT, el cicle cel·lular, la migració cel·lular, la proliferació, l'adhesió focal, la funció mitocondrial i la secreció de col·lagen [38-40]. La via de senyalització PI3K/AKT activada pot activar les cèl·lules mare hematopoètiques (HSC), que són les cèl·lules responsables de la producció de matriu extracel·lular (MEC), i la seva desregulació pot contribuir a l'aparició i progressió de la fibrosi hepàtica [40]. A més, AKT és un dels factors clau de supervivència cel·lular que inhibeix l'apoptosi cel·lular dependent de p53, i l'activació d'AKT pot estar associada amb la inhibició de l'apoptosi de les cèl·lules hepàtiques [41, 42]. Els resultats obtinguts suggereixen que l'IPA pot estar implicat en l'apoptosi associada als mitocondris hepàtics afectant la decisió dels hepatòcits entre entrar en apoptosi o la supervivència. Aquests efectes poden estar regulats pels gens candidats AKT i/o YKT6, que són crítics per a l'homeòstasi hepàtica.
Els nostres resultats van mostrar que l'IPA d'1 mM va induir l'apoptosi i va disminuir la respiració mitocondrial en les cèl·lules LX-2 independentment del tractament amb TGF-β1. Cal destacar que l'apoptosi és una via important per a la resolució de la fibrosi i l'activació de les cèl·lules mare hematopoètiques (HSC), i també és un esdeveniment clau en la resposta fisiològica reversible de la fibrosi hepàtica [4, 43]. A més, la restauració de la BHI en les cèl·lules LX-2 després del tractament combinat va proporcionar nous coneixements sobre el paper potencial de l'IPA en la regulació de la bioenergètica mitocondrial. En condicions de repòs i inactives, les cèl·lules hematopoètiques normalment utilitzen la fosforilació oxidativa mitocondrial per produir ATP i tenen una baixa activitat metabòlica. D'altra banda, l'activació de les HSC millora la respiració i la biosíntesi mitocondrial per compensar les demandes energètiques d'entrar a l'estat glucolític [44]. El fet que l'IPA no afectés el potencial metabòlic i l'ECAR suggereix que la via glucolítica està menys prioritzada. De la mateixa manera, un altre estudi va mostrar que 1 mM d'IPA era capaç de modular l'activitat de la cadena respiratòria mitocondrial en cardiomiòcits, línia cel·lular d'hepatòcits humans (Huh7) i cèl·lules endotelials de la vena umbilical humana (HUVEC); Tanmateix, no es va trobar cap efecte de l'IPA sobre la glucòlisi en cardiomiòcits, cosa que suggereix que l'IPA pot afectar la bioenergètica d'altres tipus de cèl·lules [45]. Per tant, especulem que 1 mM d'IPA pot actuar com un desacoblador químic suau, ja que pot reduir significativament l'expressió gènica fibrogènica, la morfologia cel·lular i la bioenergètica mitocondrial sense canviar la quantitat de mtDNA [46]. Els desacobladors mitocondrials poden inhibir la fibrosi induïda per cultiu i l'activació de HSC [47] i reduir la producció mitocondrial d'ATP regulada o induïda per certes proteïnes com les proteïnes desacobladores (UCP) o la translocasa de nucleòtids d'adenina (ANT). Depenent del tipus de cèl·lula, aquest fenomen pot protegir les cèl·lules de l'apoptosi i/o promoure l'apoptosi [46]. No obstant això, calen més estudis per dilucidar el paper de l'IPA com a desacoblador mitocondrial en la inactivació de cèl·lules mare hematopoètiques.
A continuació, vam investigar si els canvis en la respiració mitocondrial es reflecteixen en la morfologia mitocondrial de les cèl·lules LX-2 vives. Curiosament, el tractament amb TGF-β1 altera la proporció mitocondrial d'esfèrica a intermèdia, amb una disminució de la ramificació mitocondrial i un augment de l'expressió de DRP1, un factor clau en la fissió mitocondrial [48]. A més, la fragmentació mitocondrial s'associa amb la complexitat general de la xarxa, i la transició de la fusió a la fissió és crítica per a l'activació de les cèl·lules mare hematopoètiques (HSC), mentre que la inhibició de la fissió mitocondrial condueix a l'apoptosi de les HSC [49]. Així, els nostres resultats indiquen que el tractament amb TGF-β1 pot induir una disminució de la complexitat de la xarxa mitocondrial amb una disminució de la ramificació, que és més freqüent en la fissió mitocondrial associada amb cèl·lules mare hematopoètiques (HSC) activades. A més, les nostres dades van mostrar que l'IPA podria canviar la proporció de mitocondris de forma esfèrica a intermèdia, reduint així l'expressió d'OPA1 i MFN2. Els estudis han demostrat que la regulació a la baixa d'OPA1 podria causar una disminució del potencial de membrana mitocondrial i desencadenar l'apoptosi cel·lular [50]. Se sap que MFN2 media la fusió i l'apoptosi mitocondrial [51]. Els resultats obtinguts suggereixen que la inducció de cèl·lules LX-2 per TGF-β1 i/o IPA sembla modular la forma i la mida mitocondrial, així com l'estat d'activació i la complexitat de la xarxa.
Els nostres resultats indiquen que el tractament combinat de TGFβ-1 i IPA podria reduir els paràmetres morfològics cel·lulars i del mtDNA mitjançant la regulació de l'expressió d'ARNm de gens relacionats amb la fibrosi, l'apoptosi i la supervivència en cèl·lules que evadeixen l'apoptosi. De fet, l'IPA va disminuir el nivell d'expressió d'ARNm d'AKT1 i de gens importants de la fibrosi com ara COL1A2 i MMP2, però va augmentar el nivell d'expressió de CASP8, que s'associa amb l'apoptosi. Els nostres resultats van mostrar que després del tractament amb IPA, l'expressió de BAX va disminuir i l'expressió d'ARNm de les subunitats de la família TIMP1, BCL-2 i NF-κB va augmentar, cosa que suggereix que l'IPA podria estimular els senyals de supervivència en cèl·lules mare hematopoètiques (HSC) que evadeixen l'apoptosi. Aquestes molècules poden actuar com a senyals pro-supervivència en cèl·lules mare hematopoètiques activades, cosa que pot estar associada amb una major expressió de proteïnes antiapoptòtiques (com ara Bcl-2), una disminució de l'expressió de BAX proapoptòtic i una interacció complexa entre TIMP i NF-κB [5, 7]. L'IPA exerceix els seus efectes a través del PXR, i vam descobrir que el tractament combinat amb TGF-β1 i IPA va augmentar els nivells d'expressió d'ARNm de PXR, cosa que indica la supressió de l'activació de les HSC. Se sap que la senyalització PXR activada inhibeix l'activació de les HSC tant in vivo com in vitro [52, 53]. Els nostres resultats indiquen que l'IPA pot participar en l'eliminació de les HSC activades promovent l'apoptosi, reduint la fibrosi i el metabolisme mitocondrial, i millorant els senyals de supervivència, que són processos típics que converteixen el fenotip de HSC activat en un d'inactivat. Una altra possible explicació del mecanisme i el paper potencial de l'IPA en l'apoptosi és que elimina els mitocondris disfuncionals principalment a través de la mitofàgia (via intrínseca) i la via de senyalització extrínseca del TNF (Taula 1), que està directament relacionada amb la via de senyalització de supervivència NF-κB (Figura suplementària 7). Curiosament, els gens enriquits relacionats amb l'IPA són capaços d'induir senyals proapoptòtics i prosupervivència en la via apoptòtica [54], cosa que suggereix que l'IPA pot induir la via apoptòtica o la supervivència interactuant amb aquests gens. Tanmateix, no està clar com l'IPA indueix l'apoptosi o la supervivència durant l'activació de les HSC i les seves vies mecanístiques.
L'IPA és un metabòlit microbià format a partir del triptòfan dietètic a través de la microbiota intestinal. Els estudis han demostrat que té propietats reguladores antiinflamatòries, antioxidants i epigenètiques en l'entorn intestinal.[55] Els estudis han demostrat que l'IPA pot modular la funció de barrera intestinal i reduir l'estrès oxidatiu, cosa que pot contribuir als seus efectes fisiològics locals.[56] De fet, l'IPA es transporta als òrgans diana a través de la circulació i, com que l'IPA comparteix una estructura de metabòlit principal similar amb el triptòfan, la serotonina i els derivats de l'indol, l'IPA exerceix accions metabòliques que resulten en destins metabòlics competitius.[52] L'IPA pot competir amb els metabòlits derivats del triptòfan pels llocs d'unió en enzims o receptors, cosa que podria interrompre les vies metabòliques normals. Això destaca la necessitat de més estudis sobre la seva farmacocinètica i farmacodinàmica per entendre millor la seva finestra terapèutica.[57] Queda per veure si això també pot ocórrer en cèl·lules mare hematopoètiques (HSC).
Reconeixem que el nostre estudi té algunes limitacions. Per examinar específicament les associacions relacionades amb l'IPA, vam excloure pacients amb diabetis mellitus tipus 2 (DM2). Reconeixem que això limita l'àmplia aplicabilitat dels nostres resultats a pacients amb diabetis mellitus tipus 2 i malaltia hepàtica avançada. Tot i que la concentració fisiològica d'IPA en el sèrum humà és d'1 a 10 μM [11, 20], es va triar una concentració d'1 mM d'IPA en funció de la concentració no tòxica més alta [15] i la taxa d'apoptosi més alta, sense cap diferència en el percentatge de la població de cèl·lules necròtiques. Tot i que en aquest estudi es van utilitzar nivells suprafisiològics d'IPA, actualment no hi ha consens pel que fa a la dosi efectiva d'IPA [52]. Tot i que els nostres resultats són significatius, el destí metabòlic més ampli de l'IPA continua sent una àrea activa de recerca. A més, els nostres resultats sobre l'associació entre els nivells sèrics d'IPA i la metilació de l'ADN de les transcrites hepàtiques es van obtenir no només de cèl·lules mare hematopoètiques (HSC), sinó també de teixits hepàtics. Vam optar per utilitzar cèl·lules humanes LX-2 basant-nos en les nostres troballes prèvies de l'anàlisi del transcriptoma que l'IPA està associat amb l'activació de cèl·lules mare hematopoètiques (HSC) [15], i les HSC són les principals cèl·lules implicades en la progressió de la fibrosi hepàtica. El fetge està compost per múltiples tipus de cèl·lules, per la qual cosa s'haurien de considerar altres models cel·lulars com el sistema de cocultiu hepatòcit-HSC-cèl·lules immunitàries combinat amb l'activació de la caspasa i la fragmentació de l'ADN, així com el mecanisme d'acció, inclòs el nivell de proteïnes, per estudiar el paper de l'IPA i la seva interacció amb altres tipus de cèl·lules hepàtiques.