L'article forma part del tema de recerca "Millora de la resistència de les llegums a patògens i plagues", vegeu els 5 articles
L'agent causant de la necrosi fúngica de les plantes Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary utilitza una estratègia de diversos nivells per infectar diferents plantes hostes. Aquest estudi proposa l'ús de la diamina L-ornitina, un aminoàcid no proteic que estimula la síntesi d'altres aminoàcids essencials, com a estratègia de gestió alternativa per millorar les respostes moleculars, fisiològiques i bioquímiques de Phaseolus vulgaris L. a la floridura blanca causada per Pseudomonas sclerotiorum. Els experiments in vitro van mostrar que la L-ornitina inhibia significativament el creixement micelial de S. pyrenoidosa de manera dependent de la dosi. A més, podria reduir significativament la gravetat de la floridura blanca en condicions d'hivernacle. A més, la L-ornitina va estimular el creixement de les plantes tractades, cosa que indica que les concentracions provades de L-ornitina no eren fitotòxiques per a les plantes tractades. A més, la L-ornitina va millorar l'expressió d'antioxidants no enzimàtics (fenòlics i flavonoides totals solubles) i antioxidants enzimàtics (catalasa (CAT), peroxidasa (POX) i polifenol oxidasa (PPO)), i va augmentar l'expressió de tres gens relacionats amb els antioxidants (PvCAT1, PvSOD i PvGR). A més, l'anàlisi in silico va revelar la presència d'una suposada proteïna oxaloacetat acetilhidrolasa (SsOAH) al genoma de S. sclerotiorum, que era molt similar a les proteïnes oxaloacetat acetilhidrolasa (SsOAH) d'Aspergillus fijiensis (AfOAH) i Penicillium sp. (PlOAH) pel que fa a l'anàlisi funcional, els dominis conservats i la topologia. Curiosament, l'addició de L-ornitina al medi de brou de dextrosa de patata (PDB) va disminuir significativament l'expressió del gen SsOAH en els miceli de S. sclerotiorum. De la mateixa manera, l'aplicació exògena de L-ornitina va disminuir significativament l'expressió del gen SsOAH en els micelios fúngics recollits de plantes tractades. Finalment, l'aplicació de L-ornitina va disminuir significativament la secreció d'àcid oxàlic tant en el medi PDB com en les fulles infectades. En conclusió, la L-ornitina juga un paper clau en el manteniment de l'estat redox, així com en la millora de la resposta de defensa de les plantes infectades. Els resultats d'aquest estudi poden ajudar a desenvolupar mètodes innovadors i respectuosos amb el medi ambient per controlar la floridura blanca i mitigar el seu impacte en la producció de mongetes i altres cultius.
La floridura blanca, causada pel fong necròtrof Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary, és una malaltia devastadora que redueix el rendiment i representa una greu amenaça per a la producció mundial de mongetes (Phaseolus vulgaris L.) (Bolton et al., 2006). Sclerotinia sclerotiorum és un dels patògens vegetals fúngics transmesos pel sòl més difícils de controlar, amb una àmplia gamma d'hostes de més de 600 espècies de plantes i la capacitat de macerar ràpidament els teixits hostes de manera inespecífica (Liang i Rollins, 2018). En condicions desfavorables, passa per una fase crítica del seu cicle de vida, romanent latent durant llargs períodes com a estructures negres, dures i semblants a llavors anomenades "esclerocis" al sòl o com a creixements blancs i esponjosos al miceli o a la medul·la de la tija de les plantes infectades (Schwartz et al., 2005). S. sclerotiorum és capaç de formar esclerocis, cosa que li permet sobreviure en camps infectats durant llargs períodes i persistir durant la malaltia (Schwartz et al., 2005). Els esclerocis són rics en nutrients, poden persistir al sòl durant llargs períodes i serveixen com a inòcul principal per a infeccions posteriors (Schwartz et al., 2005). En condicions favorables, els esclerocis germinen i produeixen espores transportades per l'aire que poden infectar totes les parts superficials de la planta, incloent-hi, entre d'altres, flors, tiges o beines (Schwartz et al., 2005).
Sclerotinia sclerotiorum utilitza una estratègia de diversos nivells per infectar les seves plantes hostes, que implica una sèrie d'esdeveniments coordinats des de la germinació esclerocial fins al desenvolupament de símptomes. Inicialment, S. sclerotiorum produeix espores en suspensió (anomenades ascòspores) a partir d'estructures semblants a bolets anomenades apotecis, que es transporten per l'aire i es desenvolupen en esclerocis no mòbils sobre restes vegetals infectades (Bolton et al., 2006). El fong segrega àcid oxàlic, un factor de virulència, per controlar el pH de la paret cel·lular de la planta, promoure la degradació enzimàtica i la invasió de teixits (Hegedus i Rimmer, 2005) i suprimir l'esclat oxidatiu de la planta hoste. Aquest procés d'acidificació debilita la paret cel·lular de la planta, proporcionant un entorn favorable per al funcionament normal i eficient dels enzims degradants de la paret cel·lular dels fongs (CWDE), permetent que el patogen superi la barrera física i penetri en els teixits hostes (Marciano et al., 1983). Un cop penetrada, S. sclerotiorum segrega diversos CWDE, com ara la poligalacturonasa i la cel·lulasa, que faciliten la seva disseminació en els teixits infectats i causen necrosi tissular. La progressió de les lesions i les mates d'hifes condueix als símptomes característics de la floridura blanca (Hegedus i Rimmer, 2005). Mentrestant, les plantes hostes reconeixen els patrons moleculars associats a patògens (PAMP) a través dels receptors de reconeixement de patrons (PRR), desencadenant una sèrie d'esdeveniments de senyalització que finalment activen les respostes de defensa.
Malgrat dècades d'esforços per controlar malalties, l'escassetat de germoplasma resistent adequat persisteix en la mongeta, com en altres cultius comercials, a causa de la resistència, la supervivència i l'adaptabilitat del patogen. Per tant, la gestió de malalties és extremadament difícil i requereix una estratègia integrada i multifacètica que inclogui una combinació de pràctiques culturals, control biològic i fungicides químics (O'Sullivan et al., 2021). El control químic de la floridura blanca és el més eficaç perquè els fungicides, quan s'apliquen correctament i en el moment adequat, poden controlar eficaçment la propagació de la malaltia, reduir la gravetat de la infecció i minimitzar les pèrdues de rendiment. Tanmateix, l'ús excessiu i la dependència excessiva dels fungicides poden conduir a l'aparició de soques resistents de S. sclerotiorum i afectar negativament els organismes no objectiu, la salut del sòl i la qualitat de l'aigua (Le Cointe et al., 2016; Ceresini et al., 2024). Per tant, trobar alternatives respectuoses amb el medi ambient s'ha convertit en una prioritat màxima.
Les poliamines (AP), com la putrescina, l'espermidina, l'espermina i la cadaverina, poden servir com a alternatives prometedores contra els patògens vegetals del sòl, reduint així completament o parcialment l'ús de fungicides químics perillosos (Nehela et al., 2024; Yi et al., 2024). En les plantes superiors, les AP participen en molts processos fisiològics, incloent-hi, entre d'altres, la divisió cel·lular, la diferenciació i la resposta a estressos abiòtics i biòtics (Killiny i Nehela, 2020). Poden actuar com a antioxidants, ajudar a eliminar espècies reactives d'oxigen (ROS), mantenir l'homeòstasi redox (Nehela i Killiny, 2023), induir gens relacionats amb la defensa (Romero et al., 2018), regular diverses vies metabòliques (Nehela i Killiny, 2023), modular les fitohormones endògenes (Nehela i Killiny, 2019), establir resistència sistèmica adquirida (SAR) i regular les interaccions planta-patogen (Nehela i Killiny, 2020; Asija et al., 2022; Czerwoniec, 2022). Cal destacar que els mecanismes i les funcions específiques dels PA en la defensa de les plantes varien segons les espècies vegetals, els patògens i les condicions ambientals. Els PA més abundants a les plantes es biosintetitzen a partir de la poliamina essencial L-ornitina (Killiny i Nehela, 2020).
La L-ornitina juga múltiples funcions en el creixement i desenvolupament de les plantes. Per exemple, estudis previs han demostrat que en l'arròs (Oryza sativa), l'ornitina pot estar associada amb el reciclatge de nitrogen (Liu et al., 2018), el rendiment, la qualitat i l'aroma de l'arròs (Lu et al., 2020) i la resposta a l'estrès hídric (Yang et al., 2000). A més, l'aplicació exògena de L-ornitina va millorar significativament la tolerància a la sequera en la remolatxa sucrera (Beta vulgaris) (Hussein et al., 2019) i va alleujar l'estrès salí en les plantes de ceba (Allium Cepa) (Çavuşoǧlu i Çavuşoǧlu, 2021) i anacard (Anacardium occidentale) (da Rocha et al., 2012). El paper potencial de la L-ornitina en la defensa contra l'estrès abiòtic pot ser degut a la seva implicació en l'acumulació de prolina en les plantes tractades. Per exemple, s'ha descrit anteriorment que gens relacionats amb el metabolisme de la prolina, com ara els gens de l'ornitina delta aminotransferasa (delta-OAT) i la prolina deshidrogenasa (ProDH1 i ProDH2), estan implicats en la defensa de Nicotiana benthamiana i Arabidopsis thaliana contra soques de Pseudomonas syringae que no són hostes (Senthil-Kumar i Mysore, 2012). D'altra banda, l'ornitina descarboxilasa fúngica (ODC) és necessària per al creixement de patògens (Singh et al., 2020). La focalització de l'ODC de Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici mitjançant el silenciament gènic induït per l'hoste (HIGS) va augmentar significativament la resistència de les plantes de tomàquet a la marchitació per Fusarium (Singh et al., 2020). Tanmateix, el paper potencial de l'aplicació exògena d'ornitina contra els estressos biòtics com els fitopatògens no s'ha estudiat bé. Més important encara, els efectes de l'ornitina sobre la resistència a les malalties i els fenòmens bioquímics i fisiològics associats romanen en gran part inexplorats.
Comprendre la complexitat de la infecció per S. sclerotiorum en lleguminoses és important per al desenvolupament d'estratègies de control efectives. En aquest estudi, el nostre objectiu era identificar el paper potencial de la diamina L-ornitina com a factor clau en la millora dels mecanismes de defensa i la resistència de les plantes de lleguminoses a la infecció per Sclerotinia sclerotiorum. La nostra hipòtesi és que, a més de millorar les respostes de defensa de les plantes infectades, la L-ornitina també juga un paper clau en el manteniment de l'estat redox. Proposem que els efectes potencials de la L-ornitina estan relacionats amb la regulació dels mecanismes de defensa antioxidants enzimàtics i no enzimàtics i la interferència amb els factors de patogenicitat/virulència fúngica i les proteïnes associades. Aquesta doble funcionalitat de la L-ornitina la converteix en una candidata prometedora per a una estratègia sostenible per mitigar l'impacte de la floridura blanca i millorar la resistència dels cultius de lleguminoses comunes a aquest potent patogen fúngic. Els resultats del present estudi poden ajudar en el desenvolupament de mètodes innovadors i respectuosos amb el medi ambient per controlar la floridura blanca i mitigar el seu impacte en la producció de lleguminoses.
En aquest estudi, es va utilitzar com a material experimental una varietat comercial susceptible de mongeta comuna, Giza 3 (Phaseolus vulgaris L. cv. Giza 3). El Departament de Recerca de Lleguminoses, Institut de Recerca de Cultius de Camp (FCRI), Centre de Recerca Agrícola (ARC), Egipte, va proporcionar amablement llavors sanes. Es van sembrar cinc llavors en testos de plàstic (diàmetre interior 35 cm, profunditat 50 cm) plens de sòl infectat amb S. sclerotiorum en condicions d'hivernacle (25 ± 2 °C, humitat relativa 75 ± 1%, 8 h de llum/16 h de foscor). Al cap de 7-10 dies de la sembra (DPS), les plàntules es van aclarir per deixar només dues plàntules amb un creixement uniforme i tres fulles completament expandides a cada test. Totes les plantes en test es van regar un cop cada dues setmanes i es van fertilitzar mensualment a la dosi recomanada per a la varietat en qüestió.
Per preparar una concentració de 500 mg/L de L-ornitinadiamina (també coneguda com a àcid (+)-(S)-2,5-diaminopentanoic; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Alemanya), primer es van dissoldre 50 mg en 100 mL d'aigua destil·lada estèril. A continuació, es va diluir la solució mare i es va utilitzar en experiments posteriors. Breument, es van provar in vitro sis sèries de concentracions de L-ornitina (12,5, 25, 50, 75, 100 i 125 mg/L). A més, es va utilitzar aigua destil·lada estèril com a control negatiu (Mock) i es va utilitzar el fungicida comercial "Rizolex-T" en pols humectable al 50% (toclofos-metil 20% + tiram 30%; KZ-Kafr El Zayat Pesticides and Chemicals Company, Kafr El Zayat, Governorat de Gharbia, Egipte) com a control positiu. El fungicida comercial "Rizolex-T" es va provar in vitro a cinc concentracions (2, 4, 6, 8 i 10 mg/L).
Es van recollir mostres de tiges i beines de mongetes comunes que mostraven símptomes típics de floridura blanca (taxa d'infestació: 10-30%) en granges comercials. Tot i que la majoria dels materials vegetals infectats es van identificar per espècie/varietat (varietat comercial susceptible Giza 3), d'altres, especialment els obtinguts dels mercats locals, eren d'espècies desconegudes. Els materials infectats recollits es van desinfectar primer amb una solució d'hipoclorit de sodi al 0,5% durant 3 minuts, després es van esbandir diverses vegades amb aigua destil·lada estèril i es van assecar amb paper de filtre estèril per eliminar l'excés d'aigua. Els òrgans infectats es van tallar en petits trossos del teixit mitjà (entre els teixits sans i els infectats), es van cultivar en un medi d'agar dextrosa de patata (PDA) i es van incubar a 25 ± 2 °C amb un cicle de 12 h de llum/12 h de foscor durant 5 dies per estimular la formació d'esclerocis. El mètode de la punta micelial també es va utilitzar per purificar aïllats de fongs de cultius mixtos o contaminats. L'aïllat de fongs purificat es va identificar primer en funció de les seves característiques morfològiques culturals i després es va confirmar que era S. sclerotiorum en funció de les característiques microscòpiques. Finalment, tots els aïllats purificats es van provar per a la seva patogenicitat en el cultivar de mongeta comuna susceptible Giza 3 per complir els postulats de Koch.
A més, l'aïllat de S. sclerotiorum més invasiu (aïllat núm. 3) es va confirmar encara més basant-se en la seqüenciació d'espaiador transcrit intern (ITS), tal com descriuen White et al., 1990; Baturo-Ciesniewska et al., 2017. Breument, els aïllats es van cultivar en brou de dextrosa de patata (PDB) i es van incubar a 25 ± 2 °C durant 5-7 dies. A continuació, es va recollir el miceli fúngic, es va filtrar a través d'una gasa, es va rentar dues vegades amb aigua estèril i es va assecar amb paper de filtre estèril. L'ADN genòmic es va aïllar utilitzant el kit Quick-DNA™ Fungal/Bacterial Miniprep (Kuramae-Izioka, 1997; Atallah et al., 2022, 2024). La regió de l'ADNr ITS es va amplificar utilitzant el parell d'encebadors específic ITS1/ITS4 (TCCGTAGGTGAACCTGCGG TCCTCCGCTTATTGATATGC; mida esperada: 540 pb) (Baturo-Ciesniewska et al., 2017). Els productes de PCR purificats es van enviar per a la seqüenciació (Beijing Aoke Dingsheng Biotechnology Co., Ltd.). Les seqüències d'ADNr ITS es van seqüenciar bidireccionalment utilitzant el mètode de seqüenciació Sanger. Les seqüències de consulta assemblades es van comparar amb les dades més recents del GenBank i del Centre Nacional d'Informació Biotecnològica (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/) utilitzant el programari BLASTn. La seqüència de consulta es va comparar amb altres 20 soques/aïllats de S. sclerotiorum recuperats de les dades més recents del GenBank del NCBI (Taula suplementària S1) utilitzant ClustalW al Molecular Evolutionary Genetics Analysis Package (MEGA-11; versió 11) (Kumar et al., 2024). L'anàlisi evolutiva es va dur a terme utilitzant el mètode de màxima versemblança i el model general de substitució de nucleòtids reversible en el temps (Nei i Kumar, 2000). Es mostra l'arbre amb la log-verosimil·litat més alta. L'arbre inicial per a la cerca heurística es selecciona escollint l'arbre amb la log-verosimil·litat més alta entre l'arbre neighbor-joining (NJ) (Kumar et al., 2024) i l'arbre de màxima parsimònia (MP). L'arbre NJ es va construir utilitzant una matriu de distàncies per parells calculada mitjançant el model general reversible en el temps (Nei i Kumar, 2000).
L'activitat antibacteriana de la L-ornitina i del bactericida "Rizolex-T" es va determinar in vitro mitjançant el mètode de difusió amb agar. Mètode: Prendre la quantitat adequada de la solució stock de L-ornitina (500 mg/L) i barrejar-la bé amb 10 ml del medi nutritiu PDA per preparar solucions amb concentracions finals de 12,5, 25, 50, 75, 100 i 125 mg/L, respectivament. Es van utilitzar cinc concentracions del fungicida "Rizolex-T" (2, 4, 6, 8 i 10 mg/L) i aigua destil·lada estèril com a control. Després que el medi s'hagués solidificat, es va transferir un tap micelial acabat de preparar de cultiu de Sclerotinia sclerotiorum, de 4 mm de diàmetre, al centre de la placa de Petri i es va cultivar a 25 ± 2 °C fins que el miceli va cobrir tota la placa de Petri de control, després de la qual cosa es va registrar el creixement del fong. Calcula el percentatge d'inhibició del creixement radial de S. sclerotiorum utilitzant l'equació 1:
L'experiment es va repetir dues vegades, amb sis rèpliques biològiques per a cada grup de control/experimental i cinc testos (dues plantes per test) per a cada rèplica biològica. Cada rèplica biològica es va analitzar dues vegades (dues rèpliques tècniques) per garantir la precisió, la fiabilitat i la reproductibilitat dels resultats experimentals. A més, es va utilitzar l'anàlisi de regressió probit per calcular la concentració inhibitòria semimàxima (IC50) i la IC99 (Prentice, 1976).
Per avaluar el potencial de la L-ornitina en condicions d'hivernacle, es van dur a terme dos experiments consecutius en tests. Breument, els tests es van omplir amb terra argilosa-sorrenca esterilitzada (3:1) i es van inocular amb un cultiu acabat de preparar de S. sclerotiorum. Primer, es va cultivar l'aïllat més invasiu de S. sclerotiorum (aïllat núm. 3) tallant un escleroci per la meitat, col·locant-lo cap per avall sobre un PDA i incubant-lo a 25 °C en foscor constant (24 h) durant 4 dies per estimular el creixement micelial. A continuació, es van prendre quatre taps d'agar de 5 mm de diàmetre de la vora davantera i es van inocular amb 100 g d'una barreja estèril de segó de blat i arròs (1:1, v/v) i tots els matrassos es van incubar a 25 ± 2 °C sota un cicle de 12 h de llum/12 h de foscor durant 5 dies per estimular la formació d'esclerocis. El contingut de tots els matrassos es va barrejar completament per garantir l'homogeneïtat abans d'afegir terra. A continuació, es van afegir 100 g de la barreja de segó colonitzador a cada test per assegurar una concentració constant de patògens. Els tests inoculats es van regar per activar el creixement dels fongs i es van col·locar en condicions d'hivernacle durant 7 dies.
A continuació, es van sembrar cinc llavors de la varietat Giza 3 a cada test. Per als tests tractats amb L-ornitina i el fungicida Rizolex-T, les llavors esterilitzades es van submergir primer durant dues hores en una solució aquosa dels dos compostos amb una concentració final de CI99 d'uns 250 mg/L i 50 mg/L, respectivament, i després es van assecar a l'aire durant una hora abans de sembrar. D'altra banda, les llavors es van submergir en aigua destil·lada estèril com a control negatiu. Després de 10 dies, abans del primer reg, es van aclarir les plàntules, deixant només dues plàntules netes a cada test. A més, per garantir la infecció amb S. sclerotiorum, es van tallar tiges de plantes de mongetes en la mateixa fase de desenvolupament (10 dies) en dos llocs diferents utilitzant un bisturí esterilitzat i es van col·locar aproximadament 0,5 g de la barreja de segó colonitzadora a cada ferida, seguit d'una humitat elevada per estimular la infecció i el desenvolupament de la malaltia en totes les plantes inoculades. Les plantes de control van ser ferides de manera similar i es va col·locar una quantitat igual (0,5 g) de barreja de segó estèril i no colonitzada a la ferida i es va mantenir a alta humitat per simular l'entorn per al desenvolupament de la malaltia i garantir la consistència entre els grups de tractament.
Mètode de tractament: Les plàntules de mongetes es van regar amb 500 ml d'una solució aquosa de L-ornitina (250 mg/l) o el fungicida Rizolex-T (50 mg/l) regant el sòl, i després es va repetir el tractament tres vegades amb un interval de 10 dies. Els controls tractats amb placebo es van regar amb 500 ml d'aigua destil·lada estèril. Tots els tractaments es van dur a terme en condicions d'hivernacle (25 ± 2 °C, 75 ± 1% d'humitat relativa i un fotoperíode de 8 h de llum/16 h de foscor). Tots els tests es van regar quinzenalment i es van tractar mensualment amb un fertilitzant NPK equilibrat (20-20-20, amb un 3,6% de sofre i microelements TE; Zain Seeds, Egipte) a una concentració de 3-4 g/l mitjançant polvorització foliar segons les recomanacions per a la varietat específica i les instruccions del fabricant. A menys que s'indiqui el contrari, es van recollir fulles madures completament expandides (2a i 3a fulles des de dalt) de cada rèplica biològica a les 72 h posteriors al tractament (hpt), es van homogeneïtzar, es van agrupar i es van emmagatzemar a -80 °C per a anàlisis posteriors, incloent-hi, entre d'altres, la localització histoquímica in situ d'indicadors d'estrès oxidatiu, la peroxidació lipídica, els antioxidants enzimàtics i no enzimàtics i l'expressió gènica.
La intensitat de la infecció per floridura blanca es va avaluar setmanalment 21 dies després de la inoculació (dpi) utilitzant una escala d'1 a 9 (Taula suplementària S2) basada en l'escala de Petzoldt i Dickson (1996) modificada per Teran et al. (2006). Breument, es van examinar les tiges i les branques de les plantes de mongetes començant pel punt d'inoculació per seguir la progressió de les lesions al llarg dels internodes i els nodes. A continuació, es va mesurar la distància de la lesió des del punt d'inoculació fins al punt més allunyat de la tija o branca i es va assignar una puntuació d'1 a 9 en funció de la ubicació de la lesió, on (1) indicava que no hi havia infecció visible a prop del punt d'inoculació i (2-9) indicava un augment gradual de la mida de la lesió i la progressió al llarg dels nodes/internodes (Taula suplementària S2). La intensitat de la infecció per floridura blanca es va convertir en percentatge mitjançant la fórmula 2:
A més, l'àrea sota la corba de progressió de la malaltia (AUDPC) es va calcular mitjançant la fórmula (Shaner i Finney, 1977), que recentment s'ha adaptat per a la podridura blanca de la mongeta comuna (Chauhan et al., 2020) mitjançant l'equació 3:
On Yi = gravetat de la malaltia en el moment ti, Yi+1 = gravetat de la malaltia en el següent moment ti+1, ti = hora de la primera mesura (en dies), ti+1 = hora de la següent mesura (en dies), n = nombre total de punts temporals o punts d'observació. Els paràmetres de creixement de la planta de mongetes, incloent l'alçada de la planta (cm), el nombre de branques per planta i el nombre de fulles per planta, es van registrar setmanalment durant 21 dies en totes les rèpliques biològiques.
En cada rèplica biològica, es van recollir mostres de fulles (segona i tercera fulla completament desenvolupada des de la part superior) el dia 45 després del tractament (15 dies després de l'últim tractament). Cada rèplica biològica constava de cinc testos (dues plantes per test). Es van utilitzar uns 500 mg del teixit triturat per a l'extracció de pigments fotosintètics (clorofil·la a, clorofil·la b i carotenoides) utilitzant acetona al 80% a 4 °C a les fosques. Després de 24 h, les mostres es van centrifugar i es va recollir el sobrenedant per a la determinació colorimètrica del contingut de clorofil·la a, clorofil·la b i carotenoides mitjançant un espectrofotòmetre UV-160A (Shimadzu Corporation, Japó) segons el mètode de (Lichtenthaler, 1987) mesurant l'absorbància a tres longituds d'ona diferents (A470, A646 i A663 nm). Finalment, el contingut de pigments fotosintètics es va calcular mitjançant les fórmules següents 4-6 descrites per Lichtenthaler (1987).
A les 72 h posteriors al tractament (hpt), es van recollir fulles (segona i tercera fulla completament desenvolupada des de la part superior) de cada rèplica biològica per a la localització histoquímica in situ del peròxid d'hidrogen (H2O2) i l'anió superòxid (O2•−). Cada rèplica biològica constava de cinc tests (dues plantes per test). Cada rèplica biològica es va analitzar per duplicat (dues rèpliques tècniques) per garantir la precisió, la fiabilitat i la reproductibilitat del mètode. L'H2O2 i l'O2•− es van determinar utilitzant 3,3′-diaminobenzidina (DAB; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Alemanya) o tetrazoli nitroblau (NBT; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Alemanya), respectivament, seguint els mètodes descrits per Romero-Puertas et al. (2004) i Adam et al. (1989) amb petites modificacions. Per a la localització histoquímica de H2O2 in situ, els folíols es van infiltrar al buit amb DAB al 0,1% en tampó Tris 10 mM (pH 7,8) i després es van incubar a temperatura ambient a la llum durant 60 min. Els folíols es van blanquejar en TCA al 0,15% (v/v) en etanol:cloroform 4:1 (v/v) (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, El Caire, Egipte) i després es van exposar a la llum fins que es van enfosquir. De la mateixa manera, les vàlvules es van infiltrar al buit amb tampó de fosfat de potassi 10 mM (pH 7,8) que contenia HBT al 0,1% p/v per a la localització histoquímica de O2•− in situ. Els folíols es van incubar a la llum a temperatura ambient durant 20 min, després es van blanquejar com s'ha indicat anteriorment i després es van il·luminar fins que van aparèixer taques blau fosc/violeta. La intensitat del color marró resultant (com a indicador d'H2O2) o blau-violeta (com a indicador d'O2•−) es va avaluar mitjançant la versió de Fiji del paquet de processament d'imatges ImageJ (http://fiji.sc; consultat el 7 de març de 2024).
El malondialdehid (MDA; com a marcador de la peroxidació lipídica) es va determinar segons el mètode de Du i Bramlage (1992) amb lleugeres modificacions. Es van recollir fulles de cada rèplica biològica (segona i tercera fulles completament desenvolupades des de la part superior) 72 h després del tractament (hpt). Cada rèplica biològica incloïa cinc testos (dues plantes per test). Cada rèplica biològica es va analitzar per duplicat (dues rèpliques tècniques) per garantir la precisió, la fiabilitat i la reproductibilitat del mètode. Breument, es van utilitzar 0,5 g de teixit foliar mòlt per a l'extracció de MDA amb un 20% d'àcid tricloroacètic (TCA; MilliporeSigma, Burlington, MA, EUA) que contenia un 0,01% d'hidroxitoluè butilat (BHT; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA). El contingut de MDA al sobrenedant es va determinar colorimètricament mesurant l'absorbància a 532 i 600 nm utilitzant un espectrofotòmetre UV-160A (Shimadzu Corporation, Japó) i després es va expressar com a nmol g−1 FW.
Per a l'avaluació dels antioxidants enzimàtics i no enzimàtics, es van recollir fulles (segona i tercera fulla completament desenvolupada des de la part superior) de cada rèplica biològica a les 72 h posteriors al tractament (hpt). Cada rèplica biològica constava de cinc tests (dues plantes per test). Cada mostra biològica es va analitzar per duplicat (dues mostres tècniques). Es van moldre dues fulles amb nitrogen líquid i es van utilitzar directament per a la determinació d'antioxidants enzimàtics i no enzimàtics, aminoàcids totals, contingut de prolina, expressió gènica i quantificació d'oxalat.
Els compostos fenòlics totals solubles es van determinar utilitzant el reactiu de Folin-Ciocalteu (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) amb lleugeres modificacions del mètode descrit per Kahkonen et al. (1999). Breument, es van extreure aproximadament 0,1 g de teixit foliar homogeneïttzat amb 20 ml de metanol al 80% a les fosques durant 24 h i es va recollir el sobrenedant després de la centrifugació. Es van barrejar 0,1 ml de l'extracte de mostra amb 0,5 ml de reactiu de Folin-Ciocalteu (10%), es va agitar durant 30 s i es va deixar a les fosques durant 5 min. A continuació, es van afegir 0,5 ml de solució de carbonat de sodi al 20% (Na2CO3; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies Company, El Caire, Egipte) a cada tub, es va barrejar bé i es va incubar a temperatura ambient a les fosques durant 1 h. Després de la incubació, es va mesurar l'absorbància de la mescla de reacció a 765 nm utilitzant un espectrofotòmetre UV-160A (Shimadzu Corporation, Japó). La concentració de fenols totals solubles en els extractes de mostra es va determinar mitjançant una corba de calibratge d'àcid gàl·lic (Fisher Scientific, Hampton, NH, EUA) i es va expressar com a mil·ligrams d'equivalent d'àcid gàl·lic per gram de pes fresc (mg GAE g-1 de pes fresc).
El contingut total de flavonoides solubles es va determinar segons el mètode de Djeridane et al. (2006) amb lleugeres modificacions. Breument, es van barrejar 0,3 ml de l'extracte de metanol anterior amb 0,3 ml de solució de clorur d'alumini al 5% (AlCl3; Fisher Scientific, Hampton, NH, EUA), es van agitar vigorosament i després es van incubar a temperatura ambient durant 5 minuts, seguit de l'addició de 0,3 ml de solució d'acetat de potassi al 10% (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, El Caire, Egipte), es van barrejar completament i es van incubar a temperatura ambient durant 30 minuts a les fosques. Després de la incubació, es va mesurar l'absorbància de la mescla de reacció a 430 nm mitjançant un espectrofotòmetre UV-160A (Shimadzu Corporation, Japó). La concentració de flavonoides solubles totals en extractes de mostra es va determinar mitjançant una corba de calibratge de rutina (TCI America, Portland, OR, EUA) i després es va expressar com a mil·ligrams d'equivalent de rutina per gram de pes fresc (mg RE g-1 de pes fresc).
El contingut total d'aminoàcids lliures de les fulles de mongeta es va determinar mitjançant un reactiu de ninhidrina modificat (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, EUA) basat en el mètode proposat per Yokoyama i Hiramatsu (2003) i modificat per Sun et al. (2006). Breument, es van extreure 0,1 g de teixit mòlt amb tampó de pH 5,4 i es van fer reaccionar 200 μL del sobrenedant amb 200 μL de ninhidrina (2%) i 200 μL de piridina (10%; Spectrum Chemical, New Brunswick, NJ, EUA), es va incubar en un bany d'aigua bullent durant 30 min, després es va refredar i es va mesurar a 580 nm mitjançant un espectrofotòmetre UV-160A (Shimadzu Corporation, Japó). D'altra banda, la prolina es va determinar mitjançant el mètode Bates (Bates et al., 1973). La prolina es va extreure amb àcid sulfosalicílic al 3% (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, EUA) i, després de la centrifugació, es van barrejar 0,5 ml del sobrenedant amb 1 ml d'àcid acètic glacial (Fisher Scientific, Hampton, NH, EUA) i reactiu de ninhidrina, es va incubar a 90 °C durant 45 min, es va refredar i es va mesurar a 520 nm utilitzant el mateix espectrofotòmetre que l'anterior. Els aminoàcids lliures totals i la prolina en els extractes de fulles es van determinar mitjançant corbes de calibratge de glicina i prolina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA), respectivament, i es van expressar com a mg/g de pes fresc.
Per determinar l'activitat enzimàtica dels enzims antioxidants, es van extreure aproximadament 500 mg de teixit homogeneïttzat amb 3 ml de tampó Tris 50 mM (pH 7,8) que contenia 1 mM EDTA-Na2 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) i un 7,5% de polivinilpirrolidona (PVP; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA), es va centrifugar a 10.000 × g durant 20 min en refrigeració (4 °C) i es va recollir el sobrenedant (extracte enzimàtic cru) (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). La catalasa (CAT) es va fer reaccionar amb 2 ml de tampó de fosfat de sodi 0,1 M (pH 6,5; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) i 100 μl de solució d'H2O2 269 mM per determinar la seva activitat enzimàtica segons el mètode d'Aebi (1984) amb lleugeres modificacions (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). L'activitat enzimàtica de la peroxidasa dependent de guaiacol (POX) es va determinar mitjançant el mètode de Harrach et al. (2009). (2008) amb petites modificacions (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023) i l'activitat enzimàtica de la polifenol oxidasa (PPO) es va determinar després de la reacció amb 2,2 ml de tampó fosfat de sodi 100 mM (pH 6,0), 100 μl de guaiacol (TCI chemicals, Portland, OR, EUA) i 100 μl de H2O2 12 mM. El mètode es va modificar lleugerament respecte a (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). L'assaig es va realitzar després de la reacció amb 3 ml de solució de catecol (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, EUA) (0,01 M) preparada recentment en tampó fosfat 0,1 M (pH 6,0). L'activitat CAT es va mesurar monitoritzant la descomposició de H2O2 a 240 nm (A240), l'activitat POX es va mesurar monitoritzant l'augment de l'absorbància a 436 nm (A436) i l'activitat PPO es va mesurar registrant les fluctuacions d'absorbància a 495 nm (A495) cada 30 s durant 3 min utilitzant un espectrofotòmetre UV-160A (Shimadzu, Japó).
La RT-PCR en temps real es va utilitzar per detectar els nivells de transcripció de tres gens relacionats amb els antioxidants, incloent la catalasa peroxisomal (PvCAT1; número d'accés del GenBank KF033307.1), la superòxid dismutasa (PvSOD; número d'accés del GenBank XM_068639556.1) i la glutatió reductasa (PvGR; número d'accés del GenBank KY195009.1), en fulles de mongeta (la segona i la tercera fulla completament desenvolupada des de la part superior) 72 h després de l'últim tractament. Breument, l'ARN es va aïllar mitjançant el kit d'extracció d'ARN total Simply P (núm. de cat. BSC52S1; BioFlux, Biori Technology, Xina) segons el protocol del fabricant. A continuació, es va sintetitzar l'ADNc mitjançant el kit de síntesi d'ADNc TOP script™ segons les instruccions del fabricant. Les seqüències d'encebadors dels tres gens anteriors es mostren a la taula suplementària S3. El PvActin-3 (número d'accés al GenBank: XM_068616709.1) es va utilitzar com a gen housekeeping i l'expressió gènica relativa es va calcular mitjançant el mètode 2-ΔΔCT (Livak i Schmittgen, 2001). Es va demostrar l'estabilitat de l'actina sota estrès biòtic (interacció incompatible entre les lleguminoses comunes i el fong antracnosi Colletotrichum lindemuthianum) i estrès abiòtic (sequera, salinitat, baixa temperatura) (Borges et al., 2012).
Inicialment vam realitzar una anàlisi in silico de tot el genoma de les proteïnes de l'oxaloacetat acetilhidrolasa (OAH) en S. sclerotiorum utilitzant l'eina proteïna-proteïna BLAST (BLASTp 2.15.0+) (Altschul et al., 1997, 2005). Breument, vam utilitzar OAH d'Aspergillus fijiensis CBS 313.89 (AfOAH; taxide: 1191702; número d'accés de GenBank XP_040799428.1; 342 aminoàcids) i Penicillium lagena (PlOAH; taxide: 94218; número d'accés de GenBank XP_056833920.1; 316 aminoàcids) com a seqüències de consulta per cartografiar la proteïna homòloga en S. sclerotiorum (taxide: 5180). BLASTp es va realitzar amb les dades del genoma de S. sclerotiorum disponibles més recentment a GenBank, al lloc web del Centre Nacional d'Informació Biotecnològica (NCBI), http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/.
A més, el gen OAH predit de S. sclerotiorum (SsOAH) i l'anàlisi evolutiva i l'arbre filogenètic d'AfOAH d'A. fijiensis CBS 313.89 i PlOAH de P. lagena es van inferir mitjançant el mètode de màxima versemblança en MEGA11 (Tamura et al., 2021) i el model basat en matrius JTT (Jones et al., 1992). L'arbre filogenètic es va combinar amb l'anàlisi d'alineament múltiple de seqüències de proteïnes de tots els gens OAH predits (SsOAH) de S. sclerotiorum i la seqüència de consulta mitjançant l'eina d'alineament basada en restriccions (COBALT; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt/re_cobalt.cgi) (Papadopoulos i Agarwala, 2007). A més, les millors seqüències d'aminoàcids coincidents de SsOAH de S. sclerotiorum es van alinear amb les seqüències de consulta (AfOAH i PlOAH) (Larkin et al., 2007) utilitzant ClustalW (http://www.genome.jp/tools-bin/clustalw), i les regions conservades de l'alineació es van visualitzar mitjançant l'eina ESPript (versió 3.0; https://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/index.php).
A més, els dominis representatius funcionals predits i els llocs conservats de S. sclerotiorum SsOAH es van classificar interactivament en diferents famílies mitjançant l'eina InterPro (https://www.ebi.ac.uk/interpro/) (Blum et al., 2021). Finalment, es va realitzar un modelatge tridimensional (3D) de l'estructura de S. sclerotiorum SsOAH predita mitjançant el Protein Homology/Analogy Recognition Engine (Phyre2 server version 2.0; http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~phyre2/html/page.cgi?id=index) (Kelley et al., 2015) i es va validar mitjançant el servidor SWISS-MODEL (https://swissmodel.expasy.org/) (Biasini et al., 2014). Les estructures tridimensionals predites (format PDB) es van visualitzar interactivament mitjançant el paquet UCSF-Chimera (versió 1.15; https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/) (Pettersen et al., 2004).
Es va utilitzar PCR quantitativa de fluorescència en temps real per determinar el nivell transcripcional d'oxaloacetat acetilhidrolasa (SsOAH; número d'accés al GenBank: XM_001590428.1) en els micelios de Sclerotinia sclerotiorum. Breument, es va inocular S. sclerotiorum en un matràs que contenia PDB i es va col·locar en una incubadora amb agitació (model: I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, EUA) a 25 ± 2 °C durant 24 h a 150 rpm i en foscor constant (24 h) per estimular el creixement micelial. Posteriorment, les cèl·lules es van tractar amb L-ornitina i el fungicida Rizolex-T a concentracions finals de IC50 (aproximadament 40 i 3,2 mg/L, respectivament) i després es van cultivar durant 24 h més en les mateixes condicions. Després de la incubació, els cultius es van centrifugar a 2500 rpm durant 5 minuts i es va recollir el sobrenedant (miceli fúngic) per a l'anàlisi de l'expressió gènica. De la mateixa manera, es va recollir miceli fúngic a les 0, 24, 48, 72, 96 i 120 h després de la infecció de plantes infectades que havien format floridura blanca i miceli cotonós a la superfície dels teixits infectats. Es va extreure ARN del miceli fúngic i després es va sintetitzar ADNc tal com s'ha descrit anteriorment. Les seqüències d'encebadors per a SsOAH es mostren a la Taula Suplementària S3. Es va utilitzar SsActin (número d'accés de GenBank: XM_001589919.1) com a gen de manteniment, i l'expressió gènica relativa es va calcular mitjançant el mètode 2-ΔΔCT (Livak i Schmittgen, 2001).
L'àcid oxàlic es va determinar en brou de dextrosa de patata (PDB) i mostres de plantes que contenien el patogen fúngic Sclerotinia sclerotiorum segons el mètode de Xu i Zhang (2000) amb lleugeres modificacions. Breument, els aïllats de S. sclerotiorum es van inocular en flascons que contenien PDB i després es van cultivar en una incubadora amb agitació (model I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, EUA) a 150 rpm a 25 ± 2 °C durant 3-5 dies en foscor constant (24 h) per estimular el creixement micelial. Després de la incubació, el cultiu fúngic es va filtrar primer a través de paper de filtre Whatman #1 i després es va centrifugar a 2500 rpm durant 5 min per eliminar el miceli residual. El sobrenedant es va recollir i emmagatzemar a 4 °C per a una determinació quantitativa addicional de l'oxalat. Per a la preparació de mostres de plantes, es van extreure aproximadament 0,1 g de fragments de teixit vegetal tres vegades amb aigua destil·lada (2 ml cada vegada). Les mostres es van centrifugar a 2500 rpm durant 5 minuts, el sobrenedant es va filtrar en sec a través de paper de filtre Whatman núm. 1 i es va recollir per a una anàlisi posterior.
Per a l'anàlisi quantitativa de l'àcid oxàlic, la mescla de reacció es va preparar en un tub amb tap de vidre en el següent ordre: 0,2 ml de mostra (o filtrat de cultiu PDB o solució estàndard d'àcid oxàlic), 0,11 ml de blau de bromofenol (BPB, 1 mM; Fisher Chemical, Pittsburgh, PA, EUA), 0,198 ml d'àcid sulfúric 1 M (H2SO4; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, El Caire, Egipte) i 0,176 ml de dicromat de potassi 100 mM (K2Cr2O7; TCI chemicals, Portland, OR, EUA), i després la solució es va diluir fins a 4,8 ml amb aigua destil·lada, es va barrejar vigorosament i es va col·locar immediatament en un bany d'aigua a 60 °C. Després de 10 min, la reacció es va aturar afegint 0,5 ml de solució d'hidròxid de sodi (NaOH; 0,75 M). L'absorbància (A600) de la mescla de reacció es va mesurar a 600 nm utilitzant un espectrofotòmetre UV-160 (Shimadzu Corporation, Japó). Es van utilitzar PDB i aigua destil·lada com a controls per a la quantificació dels filtrats de cultiu i les mostres de plantes, respectivament. Les concentracions d'àcid oxàlic en els filtrats de cultiu, expressades com a micrograms d'àcid oxàlic per mil·lilitre de medi PDB (μg.mL−1), i en els extractes de fulles, expressades com a micrograms d'àcid oxàlic per gram de pes fresc (μg.g−1 FW), es van determinar mitjançant una corba de calibratge d'àcid oxàlic (Thermo Fisher Scientific Chemicals, Waltham, MA, EUA).
Al llarg de l'estudi, tots els experiments es van dissenyar en un disseny completament aleatoritzat (CRD) amb sis rèpliques biològiques per tractament i cinc tests per rèplica biològica (dues plantes per test), tret que s'indiqui el contrari. Les rèpliques biològiques es van analitzar per duplicat (dues rèpliques tècniques). Es van utilitzar rèpliques tècniques per comprovar la reproductibilitat del mateix experiment, però no es van utilitzar en l'anàlisi estadística per evitar rèpliques espúries. Les dades es van analitzar estadísticament mitjançant l'anàlisi de la variància (ANOVA) seguida de la prova de diferència honestament significativa (HSD) de Tukey-Kramer (p ≤ 0,05). Per als experiments in vitro, els valors de IC50 i IC99 es van calcular mitjançant el model probit i es van calcular intervals de confiança del 95%.
Es van recollir un total de quatre aïllats de diferents camps de soja a la governació d'El Ghabiya, Egipte. En el medi PDA, tots els aïllats van produir miceli blanc cremós que ràpidament es va tornar blanc cotós (Figura 1A) i després beix o marró en l'estadi d'escleroci. Els esclerocis solen ser densos, negres, esfèrics o irregulars, de 5,2 a 7,7 mm de llarg i de 3,4 a 5,3 mm de diàmetre (Figura 1B). Tot i que quatre aïllats van desenvolupar un patró marginal d'esclerocis a la vora del medi de cultiu després de 10-12 dies d'incubació a 25 ± 2 °C (Fig. 1A), el nombre d'esclerocis per placa va ser significativament diferent entre ells (P < 0,001), i l'aïllat 3 va tenir el nombre més alt d'esclerocis (32,33 ± 1,53 esclerocis per placa; Fig. 1C). De la mateixa manera, l'aïllat #3 va produir més àcid oxàlic en PDB que altres aïllats (3,33 ± 0,49 μg.mL−1; Fig. 1D). L'aïllat #3 va mostrar característiques morfològiques i microscòpiques típiques del fong fitopatogènic Sclerotinia sclerotiorum. Per exemple, en PDA, les colònies de l'aïllat #3 van créixer ràpidament, eren de color blanc cremós (Figura 1A), beix invers o groc-marró salmó clar, i van requerir de 6 a 7 dies a 25 ± 2 °C per cobrir completament la superfície d'una placa de 9 cm de diàmetre. A partir de les característiques morfològiques i microscòpiques anteriors, l'aïllat #3 es va identificar com a Sclerotinia sclerotiorum.
Figura 1. Característiques i patogenicitat dels aïllats de S. sclerotiorum de cultius de lleguminoses comunes. (A) Creixement micelial de quatre aïllats de S. sclerotiorum en medi PDA, (B) esclerocis de quatre aïllats de S. sclerotiorum, (C) nombre d'esclerocis (per placa), (D) secreció d'àcid oxàlic en medi PDB (μg.mL−1) i (E) gravetat de la malaltia (%) de quatre aïllats de S. sclerotiorum en el cultivar de lleguminoses comercials susceptibles Giza 3 en condicions d'hivernacle. Els valors representen la mitjana ± SD de cinc rèpliques biològiques (n = 5). Lletres diferents indiquen diferències estadísticament significatives entre els tractaments (p < 0,05). (F–H) Símptomes típics de floridura blanca van aparèixer a les tiges i siliques sobre el terra, respectivament, 10 dies després de la inoculació amb l'aïllat #3 (dpi). (I) L'anàlisi evolutiva de la regió de l'espaiador transcrit intern (ITS) de l'aïllat núm. 3 de S. sclerotiorum es va dur a terme mitjançant el mètode de màxima versemblança i es va comparar amb 20 aïllats/soques de referència obtinguts de la base de dades del Centre Nacional d'Informació Biotecnològica (NCBI) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Els números a sobre de les línies d'agrupació indiquen la cobertura de la regió (%), i els números a sota de les línies d'agrupació indiquen la longitud de la branca.
A més, per confirmar la patogenicitat, es van utilitzar quatre aïllats de S. sclerotiorum obtinguts per inocular el cultivar comercial de mongeta susceptible Giza 3 en condicions d'hivernacle, la qual cosa és coherent amb els postulats de Koch (Fig. 1E). Tot i que tots els aïllats de fongs obtinguts eren patògens i podien infectar la mongeta verda (cv. Giza 3), causant símptomes típics de floridura blanca a totes les parts sobre el terra (Fig. 1F), especialment a les tiges (Fig. 1G) i les beines (Fig. 1H) 10 dies després de la inoculació (dpi), l'aïllat 3 va ser l'aïllat més agressiu en dos experiments independents. L'aïllat 3 va tenir la gravetat de la malaltia més alta (%) en plantes de mongeta (24,0 ± 4,0, 58,0 ± 2,0 i 76,7 ± 3,1 als 7, 14 i 21 dies després de la infecció, respectivament; Figura 1F).
La identificació de l'aïllat #3 de S. sclerotiorum més invasiu es va confirmar encara més mitjançant la seqüenciació de l'espaiador transcrit intern (ITS) (Fig. 1I). L'anàlisi filogenètica entre l'aïllat #3 i 20 aïllats/soques de referència va mostrar una alta similitud (>99%) entre ells. Cal destacar que l'aïllat #3 de S. sclerotiorum (533 pb) té una alta similitud amb l'aïllat americà LPM36 de S. sclerotiorum aïllat de llavors de pèsol sec (número d'accés del GenBank MK896659.1; 540 pb) i l'aïllat xinès YKY211 de S. sclerotiorum (número d'accés del GenBank OR206374.1; 548 pb), que causa la podridura de la tija de la violeta (Matthiola incana), tots els quals s'agrupen per separat a la part superior del dendrograma (Figura 1I). La nova seqüència s'ha dipositat a la base de dades del NCBI i s'ha anomenat "Sclerotinia sclerotiorum - aïllat YN-25" (número d'accés al GenBank PV202792). Es pot observar que l'aïllat 3 és l'aïllat més invasiu; per tant, aquest aïllat va ser escollit per a l'estudi en tots els experiments posteriors.
L'activitat antibacteriana de la diamina L-ornitina (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Alemanya) a diferents concentracions (12,5, 25, 50, 75, 100 i 125 mg/L) contra l'aïllat 3 de S. sclerotiorum es va investigar in vitro. Cal destacar que la L-ornitina va exercir un efecte antibacterià i va inhibir gradualment el creixement radial de les hifes de S. sclerotiorum de manera dependent de la dosi (Figura 2A, B). A la concentració més alta provada (125 mg/L), la L-ornitina va demostrar la taxa d'inhibició del creixement micelial més alta (99,62 ± 0,27%; Figura 2B), que era equivalent al fungicida comercial Rizolex-T (taxa d'inhibició 99,45 ± 0,39%; Figura 2C) a la concentració més alta provada (10 mg/L), cosa que indica una eficàcia similar.
Figura 2. Activitat antibacteriana in vitro de la L-ornitina contra Sclerotinia sclerotiorum. (A) Comparació de l'activitat antibacteriana de diferents concentracions de L-ornitina contra S. sclerotiorum amb el fungicida comercial Rizolex-T (10 mg/L). (B, C) Taxa d'inhibició (%) del creixement micelial de S. sclerotiorum després del tractament amb diferents concentracions de L-ornitina (12,5, 25, 50, 75, 100 i 125 mg/L) o Rizolex-T (2, 4, 6, 8 i 10 mg/L), respectivament. Els valors representen la mitjana ± SD de cinc rèpliques biològiques (n = 5). Les lletres diferents indiquen diferències estadístiques entre els tractaments (p < 0,05). (D, E) Anàlisi de regressió del model probit de la L-ornitina i el fungicida comercial Rizolex-T, respectivament. La línia de regressió del model probit es mostra com una línia blava sòlida i l'interval de confiança (95%) es mostra com una línia vermella discontínua.
A més, es va realitzar una anàlisi de regressió probit i els gràfics corresponents es mostren a la Taula 1 i a les Figures 2D i E. Breument, el valor acceptable del pendent (y = 2,92x − 4,67) i les estadístiques significatives associades (Cox & Snell R2 = 0,3709, Nagelkerke R2 = 0,4998 i p < 0,0001; Figura 2D) de la L-ornitina van indicar una activitat antifúngica millorada contra S. sclerotiorum en comparació amb el fungicida comercial Rizolex-T (y = 1,96x − 0,99, Cox & Snell R2 = 0,1242, Nagelkerke R2 = 0,1708 i p < 0,0001) (Taula 1).
Taula 1. Valors de la concentració inhibitòria semimàxima (IC50) i IC99 (mg/l) de L-ornitina i fungicida comercial "Rizolex-T" contra S. sclerotiorum.
En general, la L-ornitina (250 mg/L) va reduir significativament el desenvolupament i la gravetat de la floridura blanca en plantes de mongetes comunes tractades en comparació amb les plantes infectades amb S. sclerotiorum no tractades (control; Figura 3A). Breument, tot i que la gravetat de la malaltia de les plantes de control infectades no tractades va augmentar gradualment (52,67 ± 1,53, 83,21 ± 2,61 i 92,33 ± 3,06%), la L-ornitina va reduir significativament la gravetat de la malaltia (%) al llarg de l'experiment (8,97 ± 0,15, 18,00 ± 1,00 i 26,36 ± 3,07) als 7, 14 i 21 dies posteriors al tractament (dpt), respectivament (Figura 3A). De la mateixa manera, quan es van tractar plantes de mongetes infectades amb S. sclerotiorum amb 250 mg/L de L-ornitina, l'àrea sota la corba de progressió de la malaltia (AUDPC) va disminuir de 1274,33 ± 33,13 en el control no tractat a 281,03 ± 7,95, que va ser lleugerament inferior a la del control positiu de 50 mg/L de fungicida Rizolex-T (183,61 ± 7,71; Fig. 3B). Es va observar la mateixa tendència en el segon experiment.
Fig. 3. Efecte de l'aplicació exògena de L-ornitina sobre el desenvolupament de la podridura blanca de la mongeta comuna causada per Sclerotinia sclerotiorum en condicions d'hivernacle. (A) Corba de progressió de la malaltia de la floridura blanca de la mongeta comuna després del tractament amb 250 mg/L de L-ornitina. (B) Àrea sota la corba de progressió de la malaltia (AUDPC) de la floridura blanca de la mongeta comuna després del tractament amb L-ornitina. Els valors representen la mitjana ± SD de cinc rèpliques biològiques (n = 5). Les lletres diferents indiquen diferències estadísticament significatives entre els tractaments (p < 0,05).
L'aplicació exògena de 250 mg/L de L-ornitina va augmentar gradualment l'alçada de la planta (Fig. 4A), el nombre de branques per planta (Fig. 4B) i el nombre de fulles per planta (Fig. 4C) després de 42 dies. Mentre que el fungicida comercial Rizolex-T (50 mg/L) va tenir el major efecte en tots els paràmetres nutricionals estudiats, l'aplicació exògena de 250 mg/L de L-ornitina va tenir el segon major efecte en comparació amb els controls no tractats (Figs. 4A-C). D'altra banda, el tractament amb L-ornitina no va tenir cap efecte significatiu sobre el contingut de pigments fotosintètics clorofil·la a (Fig. 4D) i clorofil·la b (Fig. 4E), però va augmentar lleugerament el contingut total de carotenoides (0,56 ± 0,03 mg/g pes net) en comparació amb el control negatiu (0,44 ± 0,02 mg/g pes net) i el control positiu (0,46 ± 0,02 mg/g pes net; Fig. 4F). En general, aquests resultats indiquen que la L-ornitina no és fitotòxica per a les llegums tractades i fins i tot pot estimular el seu creixement.
Fig. 4. Efecte de l'aplicació exògena de L-ornitina sobre les característiques de creixement i els pigments fotosintètics de fulles de mongeta infectades amb Sclerotinia sclerotiorum en condicions d'hivernacle. (A) Alçada de la planta (cm), (B) Nombre de branques per planta, (C) Nombre de fulles per planta, (D) Contingut de clorofil·la a (mg g-1 fr wt), (E) Contingut de clorofil·la b (mg g-1 fr wt), (F) Contingut total de carotenoides (mg g-1 fr wt). Els valors són la mitjana ± SD de cinc rèpliques biològiques (n = 5). Lletres diferents indiquen diferències estadísticament significatives entre els tractaments (p < 0,05).
La localització histoquímica in situ d'espècies reactives d'oxigen (ROS; expressades com a peròxid d'hidrogen [H2O2]) i radicals lliures (expressats com a anions superòxid [O2•−]) va revelar que l'aplicació exògena de L-ornitina (250 mg/L) va reduir significativament l'acumulació d'H2O2 (96,05 ± 5,33 nmol.g−1 FW; Fig. 5A) i O2•− (32,69 ± 8,56 nmol.g−1 FW; Fig. 5B) en comparació amb l'acumulació tant de plantes infectades no tractades (173,31 ± 12,06 i 149,35 ± 7,94 nmol.g−1 FW, respectivament) com de plantes tractades amb 50 mg/L del fungicida comercial Rizolex-T (170,12 ± 9,50 i 157,00 ± 7,81 nmol.g−1 fr wt, respectivament) a les 72 h. Es van acumular alts nivells d'H2O2 i O2•− sota la temperatura alta (Fig. 5A, B). De la mateixa manera, l'assaig de malondialdehid (MDA) basat en TCA va mostrar que les plantes de mongetes infectades amb S. sclerotiorum acumulaven nivells més alts de MDA (113,48 ± 10,02 nmol.g en pes net) a les seves fulles (Fig. 5C). Tanmateix, l'aplicació exògena de L-ornitina va reduir significativament la peroxidació lipídica, com ho demostra la disminució del contingut de MDA en les plantes tractades (33,08 ± 4,00 nmol.g en pes net).
Fig. 5. Efecte de l'aplicació exògena de L-ornitina sobre els principals marcadors d'estrès oxidatiu i mecanismes de defensa antioxidant no enzimàtics en fulles de mongetes infectades amb S. sclerotiorum a les 72 h posteriors a la infecció en condicions d'hivernacle. (A) Peròxid d'hidrogen (H2O2; nmol g−1 FW) a 72 hpt, (B) anió superòxid (O2•−; nmol g−1 FW) a 72 hpt, (C) malondialdehid (MDA; nmol g−1 FW) a 72 hpt, (D) fenols solubles totals (mg GAE g−1 FW) a 72 hpt, (E) flavonoides solubles totals (mg RE g−1 FW) a 72 hpt, (F) aminoàcids lliures totals (mg g−1 FW) a 72 hpt, i (G) contingut de prolina (mg g−1 FW) a 72 hpt. Els valors representen la mitjana ± desviació estàndard (mitjana ± SD) de 5 rèpliques biològiques (n = 5). Lletres diferents indiquen diferències estadísticament significatives entre tractaments (p < 0,05).