Gràcies per visitar Nature.com. La versió del navegador que esteu utilitzant té compatibilitat limitada amb CSS. Per a una millor experiència, us recomanem que utilitzeu un navegador actualitzat (o que desactiveu el mode de compatibilitat a l'Internet Explorer). Mentrestant, per garantir una assistència continuada, mostrarem el lloc web sense estils ni JavaScript.
Les nanopartícules d'insulina (NP) amb un alt contingut de càrrega han trobat diferents aplicacions en diferents formes de dosificació. Aquest treball pretén avaluar l'efecte dels processos de liofilització i assecatge per polvorització sobre l'estructura de les nanopartícules de quitosà carregades d'insulina, amb o sense manitol com a crioprotector. També vam avaluar la qualitat d'aquestes nanopartícules redissolent-les. Abans de la deshidratació, la mida de partícula de les nanopartícules reticulades de quitosà/tripolifosfat de sodi/insulina es va optimitzar a 318 nm, el PDI va ser de 0,18, l'eficiència d'encapsulació va ser del 99,4% i la càrrega va ser del 25,01%. Després de la reconstitució, totes les nanopartícules, excepte les produïdes per un mètode de liofilització sense l'ús de manitol, van mantenir la seva estructura de partícula esfèrica. En comparació amb les nanopartícules que contenen manitol deshidratades per polvorització, les nanopartícules assecades per polvorització sense manitol també van mostrar la mida mitjana de partícula més petita (376 nm) i el contingut de càrrega més alt. (25,02%) amb una taxa d'encapsulació similar (98,7%) i PDI (0,20) mitjançant tècniques d'assecatge o liofilització. Les nanopartícules assecades mitjançant assecatge per polvorització sense manitol també van donar lloc a l'alliberament més ràpid d'insulina i a la màxima eficiència d'absorció cel·lular. Aquest treball demostra que l'assecatge per polvorització pot deshidratar nanopartícules d'insulina sense necessitat de crioprotectors en comparació amb els mètodes convencionals de liofilització, creant una major capacitat de càrrega, menors requisits d'additius i un avantatge significatiu en els costos operatius.
Des del seu descobriment el 19221,2,3, la insulina i les seves preparacions farmacèutiques han salvat la vida de pacients amb diabetis tipus 1 (DM1) i diabetis tipus 2 (DM1). Tanmateix, a causa de les seves propietats com a proteïna d'alt pes molecular, la insulina s'agrega fàcilment, es descompon mitjançant enzims proteolítics i s'elimina per l'efecte de primer pas. Les persones diagnosticades amb diabetis tipus 1 necessiten injeccions d'insulina per a la resta de la seva vida. Molts pacients diagnosticats inicialment amb diabetis tipus 2 també necessiten injeccions d'insulina a llarg termini. Les injeccions diàries d'insulina són una font greu de dolor i molèsties diàries per a aquestes persones, amb efectes negatius sobre la salut mental. Com a resultat, s'estan estudiant àmpliament altres formes d'administració d'insulina que causen menys molèsties, com l'administració oral d'insulina, ja que tenen el potencial de restaurar la qualitat de vida d'aproximadament 5.000 milions de persones amb diabetis a tot el món.
La tecnologia de nanopartícules ha proporcionat un avenç significatiu en els intents d'administrar insulina oral4,6,7. Una tecnologia que encapsula i protegeix eficaçment la insulina de la degradació per a l'administració dirigida a llocs específics del cos. Tanmateix, l'ús de formulacions de nanopartícules té diverses limitacions, principalment a causa de problemes d'estabilitat de les suspensions de partícules. Es pot produir una certa agregació durant l'emmagatzematge, cosa que redueix la biodisponibilitat de les nanopartícules carregades d'insulina8. A més, també s'ha de tenir en compte l'estabilitat química de la matriu polimèrica de les nanopartícules i la insulina per garantir l'estabilitat de les nanopartícules d'insulina (NP). Actualment, la tecnologia de liofilització és l'estàndard d'or per crear NP estables alhora que s'eviten canvis no desitjats durant l'emmagatzematge9.
Tanmateix, la liofilització requereix l'addició de crioprotectors per evitar que l'estructura esfèrica de les nanopartícules es vegi afectada per l'estrès mecànic dels cristalls de gel. Això redueix significativament la càrrega de nanopartícules d'insulina després de la liofilització, ja que el crioprotector ocupa la major part de la relació de pes. Per tant, sovint es considera que les nanopartícules d'insulina produïdes no són adequades per a la fabricació de formulacions de pols seca, com ara comprimits orals i pel·lícules orals, a causa de la necessitat de grans quantitats de nanopartícules seques per aconseguir la finestra terapèutica de la insulina.
L'assecat per polvorització és un procés a escala industrial ben conegut i econòmic per produir pols seques a partir de fases líquides a la indústria farmacèutica10,11. El control sobre el procés de formació de partícules permet l'encapsulació adequada de diversos compostos bioactius12, 13. A més, s'ha convertit en una tècnica eficaç per a la preparació de proteïnes encapsulades per a l'administració oral. Durant l'assecat per polvorització, l'aigua s'evapora molt ràpidament, cosa que ajuda a mantenir baixa la temperatura del nucli de la partícula11,14, permetent la seva aplicació per encapsular components sensibles a la calor. Abans de l'assecat per polvorització, el material de recobriment s'ha d'homogeneïtzar completament amb la solució que conté els ingredients encapsulats11,14. A diferència de la liofilització, l'homogeneïtzació abans de l'encapsulació en l'assecat per polvorització millora l'eficiència de l'encapsulació durant la deshidratació. Com que el procés d'encapsulació per assecat per polvorització no requereix crioprotectors, l'assecat per polvorització es pot utilitzar per produir nanopartícules seques amb un alt contingut de càrrega.
Aquest estudi informa de la producció de nanopartícules carregades d'insulina mitjançant l'enllaç reticulat de quitosà i tripolifosfat de sodi utilitzant un mètode de gel iònic. La gelificació iònica és un mètode de preparació que permet la producció de nanopartícules mitjançant interaccions electrostàtiques entre dues o més espècies iòniques sota certes condicions. Es van utilitzar tècniques de liofilització i assecatge per polvorització per deshidratar les nanopartícules reticulades de quitosà/tripolifosfat de sodi/insulina optimitzades. Després de la deshidratació, es va analitzar la seva morfologia mitjançant SEM. La seva capacitat de recombinació es va avaluar mesurant la seva distribució de mida, càrrega superficial, PDI, eficiència d'encapsulació i contingut de càrrega. També es va avaluar la qualitat de les nanopartícules resolubilitzades produïdes per diferents mètodes de deshidratació comparant la seva protecció contra la insulina, el comportament d'alliberament i l'eficàcia de l'absorció cel·lular.
El pH de la solució mixta i la proporció de quitosà i insulina són dos factors clau que afecten la mida de les partícules i l'eficiència d'encapsulació (EE) de les nanopartícules finals, ja que afecten directament el procés de gelificació ionotròpica. Es va demostrar que el pH de la solució mixta estava altament correlacionat amb la mida de les partícules i l'eficiència d'encapsulació (Fig. 1a). Com es mostra a la Fig. 1a, a mesura que el pH augmentava de 4,0 a 6,0, la mida mitjana de les partícules (nm) disminuïa i l'EE augmentava significativament, mentre que quan el pH augmentava a 6,5, la mida mitjana de les partícules començava a augmentar i l'EE es mantenia sense canvis. A mesura que augmenta la proporció de quitosà i insulina, també augmenta la mida mitjana de les partícules. A més, no es va observar cap canvi en l'EE quan les nanopartícules es van preparar amb una proporció en massa de quitosà/insulina superior a 2,5:1 (p/p) (Fig. 1b). Per tant, es van utilitzar les condicions òptimes de preparació en aquest estudi (pH 6,0, proporció en massa de quitosà/insulina de 2,5:1). per preparar nanopartícules carregades d'insulina per a un estudi posterior. En aquesta condició de preparació, la mida mitjana de les partícules de les nanopartícules d'insulina es va optimitzar a 318 nm (Fig. 1c), el PDI va ser de 0,18, l'eficiència d'incrustació va ser del 99,4%, el potencial zeta va ser de 9,8 mv i la càrrega d'insulina va ser del 25,01% (m/m). Segons els resultats de la microscòpia electrònica de transmissió (TEM), les nanopartícules optimitzades eren aproximadament esfèriques i discretes amb una mida relativament uniforme (Fig. 1d).
Optimització de paràmetres de nanopartícules d'insulina: (a) l'efecte del pH sobre el diàmetre mitjà i l'eficiència d'encapsulació (EE) de nanopartícules d'insulina (preparades a una proporció de massa de 5:1 de quitosà i insulina); (b) quitosà i influència de la proporció de massa d'insulina sobre el diàmetre mitjà i l'eficiència d'encapsulació (EE) de nanopartícules d'insulina (preparades a pH 6); (c) distribució de la mida de partícula de nanopartícules d'insulina optimitzades; (d) micrografia TEM de nanopartícules d'insulina optimitzades.
És ben sabut que el quitosà és un polielectròlit feble amb un pKa de 6,5. Es carrega positivament en medis àcids perquè el seu grup amino principal està protonat per ions d'hidrogen15. Per tant, sovint s'utilitza com a portador per encapsular macromolècules carregades negativament. En aquest estudi, es va utilitzar quitosà per encapsular insulina amb un punt isoelèctric de 5,3. Com que el quitosà s'utilitza com a material de recobriment, amb l'augment de la seva proporció, el gruix de la capa exterior de les nanopartícules augmenta corresponentment, donant lloc a una mida mitjana de partícula més gran. A més, nivells més alts de quitosà poden encapsular més insulina. En el nostre cas, l'EE va ser més alt quan la proporció de quitosà i insulina va arribar a 2,5:1, i no hi va haver cap canvi significatiu en l'EE quan la proporció va continuar augmentant.
A més de la proporció de quitosà i insulina, el pH també va tenir un paper crucial en la preparació de nanopartícules. Gan et al. 17 van estudiar l'efecte del pH sobre la mida de les partícules de les nanopartícules de quitosà. Van trobar una disminució contínua de la mida de les partícules fins que el pH va arribar a 6,0, i es va observar un augment significatiu de la mida de les partícules a pH > 6,0, cosa que concorda amb les nostres observacions. Aquest fenomen es deu al fet que amb l'augment del pH, la molècula d'insulina adquireix una càrrega superficial negativa, afavorint així les interaccions electrostàtiques amb el complex quitosà/tripolifosfat de sodi (TPP), donant lloc a una mida de partícula petita i un EE elevat. Tanmateix, quan el pH es va ajustar a 6,5, els grups amino del quitosà es van desprotonar, donant lloc al plegament del quitosà. Així, un pH alt provoca una menor exposició dels ions amino al TPP i a la insulina, donant lloc a una menor reticulació, una mida mitjana de partícula final més gran i un EE inferior.
L'anàlisi de les propietats morfològiques de les nanopartícules liofilitzades i assecades per polvorització pot guiar la selecció de millors tècniques de deshidratació i formació de pols. El mètode preferit hauria de proporcionar estabilitat del fàrmac, forma uniforme de les partícules, alta càrrega de fàrmac i bona solubilitat en la solució original. En aquest estudi, per comparar millor les dues tècniques, es van utilitzar nanopartícules d'insulina amb o sense manitol a l'1% durant la deshidratació. El manitol s'utilitza com a agent de volum o crioprotector en diverses formulacions de pols seca per a la liofilització i l'assecat per polvorització. Per a les nanopartícules d'insulina liofilitzades sense manitol, com es mostra a la Figura 2a, es va observar una estructura de pols altament porosa amb superfícies grans, irregulars i rugoses sota microscòpia electrònica de rastreig (SEM). Es van detectar poques partícules discretes a la pols després de la deshidratació (Fig. 2e). Aquests resultats van indicar que la majoria de les nanopartícules es van descompondre durant la liofilització sense cap crioprotector. Per a les nanopartícules d'insulina liofilitzades i assecades per polvorització que contenien manitol a l'1%, es van observar nanopartícules esfèriques amb superfícies llises (Fig. 2b, d, f, h). Les nanopartícules d'insulina assecades per polvorització sense manitol van romandre esfèriques però arrugades a la superfície (Fig. 2c). Les superfícies esfèriques i arrugades es discuteixen més a fons en les proves de comportament d'alliberament i d'absorció cel·lular que es mostren a continuació. Basant-se en l'aspecte visible de les nanopartícules assecades, tant les nanopartícules assecades per polvorització sense manitol com les nanopartícules liofilitzades i assecades per polvorització amb manitol van produir pols fines de nanopartícules (Fig. 2f, g, h). Com més gran és la superfície entre les superfícies de les partícules, més alta és la solubilitat i, per tant, més alta és la velocitat d'alliberament.
Morfologia de diferents nanopartícules d'insulina deshidratades: (a) Imatge SEM de nanopartícules d'insulina liofilitzades sense manitol; (b) Imatge SEM de nanopartícules d'insulina liofilitzades amb manitol; (c) nanopartícules d'insulina assecades per polvorització sense manitol Imatge SEM de; (d) Imatge SEM de nanopartícules d'insulina assecades per polvorització amb manitol; (e) imatge de pols de nanopartícules d'insulina liofilitzades sense manitol; (f) imatge de nanopartícules d'insulina liofilitzades amb manitol; (g) Imatge de pols de nanopartícules d'insulina assecades per polvorització sense manitol; (h) imatge de pols de nanopartícules d'insulina assecades per polvorització amb manitol.
Durant la liofilització, el manitol actua com a crioprotector, mantenint les nanopartícules en forma amorfa i evitant danys causats pels cristalls de gel19. En canvi, no hi ha cap pas de congelació durant l'assecat per polvorització. Per tant, no es requereix manitol en aquest mètode. De fet, les nanopartícules assecades per polvorització sense manitol van produir nanopartícules més fines, tal com s'ha descrit anteriorment. Tanmateix, el manitol encara pot actuar com a farciment en el procés d'assecat per polvorització per donar a les nanopartícules una estructura més esfèrica20 (Fig. 2d), cosa que ajuda a obtenir un comportament d'alliberament uniforme d'aquestes nanopartícules encapsulades. A més, és clar que es poden detectar algunes partícules grans tant en nanopartícules d'insulina liofilitzades com en nanopartícules assecades per polvorització que contenen manitol (Fig. 2b, d), cosa que pot ser deguda a l'acumulació de manitol al nucli de la partícula juntament amb la insulina encapsulada. A.Capa de quitosà.Val la pena assenyalar que en aquest estudi, per tal de garantir que l'estructura esfèrica romangui intacta després de la deshidratació, la proporció de manitol i quitosà es manté a 5:1, de manera que una gran quantitat de farciment també pot augmentar la mida de partícula de les nanopartícules seques.
L'espectroscòpia de reflexió total atenuada per infrarojos de transformada de Fourier (FTIR-ATR) va caracteritzar la mescla física d'insulina lliure, quitosà, quitosà, TPP i insulina. Totes les nanopartícules deshidratades es van caracteritzar mitjançant espectroscòpia FTIR-ATR. Cal destacar que es van observar intensitats de banda de 1641, 1543 i 1412 cm-1 en nanopartícules encapsulades liofilitzades amb manitol i en nanopartícules assecades per polvorització amb i sense manitol (Fig. 3). Com s'ha informat anteriorment, aquests augments de força es van associar amb l'enllaç creuat entre el quitosà, el TPP i la insulina. La investigació de la interacció entre el quitosà i la insulina va mostrar que en els espectres FTIR de nanopartícules de quitosà carregades d'insulina, la banda del quitosà se superposava amb la de la insulina, augmentant la intensitat del carbonil (1641 cm-1) i el cinturó d'amina (1543 cm-1). Els grups tripolifosfat del TPP estan units a grups d'amoni en el quitosà, formant una banda a 1412 cm-1.
Espectres FTIR-ATR d'insulina lliure, quitosà, mescles físiques de quitosà/TPP/insulina i nanopartícules deshidratades per diferents mètodes.
A més, aquests resultats són consistents amb els mostrats en SEM, que van mostrar que les nanopartícules encapsulades van romandre intactes tant quan es van ruixar com es van liofilitzar amb manitol, però en absència de manitol, només l'assecat per polvorització va produir partícules encapsulades. En canvi, els resultats espectrals FTIR-ATR de les nanopartícules liofilitzades sense manitol van ser molt similars a la barreja física de quitosà, TPP i insulina. Aquest resultat indica que els enllaços creuats entre el quitosà, el TPP i la insulina ja no són presents en les nanopartícules liofilitzades sense manitol. L'estructura de les nanopartícules es va destruir durant la liofilització sense crioprotector, cosa que es pot veure en els resultats de SEM (Fig. 2a). Basant-se en la morfologia i els resultats FTIR de les nanopartícules d'insulina deshidratades, només es van utilitzar nanopartícules liofilitzades, assecades per polvorització i sense manitol per als experiments de reconstitució i nanopartícules sense manitol a causa de la descomposició de les nanopartícules sense manitol durant la deshidratació. discuteix.
La deshidratació s'utilitza per a l'emmagatzematge a llarg termini i el reprocessament en altres formulacions. La capacitat de les nanopartícules seques per reconstituir-se després de l'emmagatzematge és crítica per al seu ús en diferents formulacions com ara comprimits i pel·lícules. Vam observar que la mida mitjana de les partícules de les nanopartícules d'insulina assecades per polvorització en absència de manitol només va augmentar lleugerament després de la reconstitució. D'altra banda, la mida de les partícules de les nanopartícules d'insulina assecades per polvorització i liofilitzades amb manitol va augmentar significativament (Taula 1). El PDI i l'EE no van canviar significativament (p > 0,05) després de la recombinació de totes les nanopartícules en aquest estudi (Taula 1). Aquest resultat indica que la majoria de les partícules van romandre intactes després de la redissolució. Tanmateix, l'addició de manitol va resultar en una gran reducció de la càrrega d'insulina de les nanopartícules de manitol liofilitzades i assecades per polvorització (Taula 1). En canvi, el contingut de càrrega d'insulina de les nanopartícules assecades per polvorització sense manitol va romandre igual que abans (Taula 1).
És ben sabut que la càrrega de nanopartícules és crítica quan s'utilitzen per a l'administració de fàrmacs. Per a les nanopartícules amb baixes càrregues, es necessiten grans quantitats de material per assolir el llindar terapèutic. Tanmateix, l'alta viscositat d'aquestes concentracions elevades de nanopartícules provoca inconvenients i dificultats en l'administració oral i les formulacions injectables, respectivament 22. A més, les nanopartícules d'insulina també es poden utilitzar per fer comprimits i biofilms viscosos 23, 24, cosa que requereix l'ús de grans quantitats de nanopartícules a baixos nivells de càrrega, donant lloc a comprimits grans i biofilms gruixuts que no són adequats per a aplicacions orals. Per tant, les nanopartícules deshidratades amb una alta càrrega d'insulina són molt desitjables. Els nostres resultats suggereixen que l'alta càrrega d'insulina de les nanopartícules assecades per polvorització sense manitol pot oferir molts avantatges atractius per a aquests mètodes d'administració alternatius.
Totes les nanopartícules deshidratades es van conservar a la nevera durant tres mesos. Els resultats del microscopi electrònic de vacunes (SEM) van mostrar que la morfologia de totes les nanopartícules deshidratades no va canviar significativament durant els tres mesos d'emmagatzematge (Fig. 4). Després de la reconstitució en aigua, totes les nanopartícules van mostrar una lleugera disminució de l'EE i van alliberar aproximadament una petita quantitat (~5%) d'insulina durant el període d'emmagatzematge de tres mesos (Taula 2). No obstant això, la mida mitjana de les partícules de totes les nanopartícules va augmentar. La mida de les partícules de les nanopartícules assecades per polvorització sense manitol va augmentar fins a 525 nm, mentre que la de les nanopartícules assecades per polvorització i liofilitzades amb manitol va augmentar fins a 872 i 921 nm, respectivament (Taula 2).
Morfologia de diferents nanopartícules d'insulina deshidratades emmagatzemades durant tres mesos: (a) Imatge SEM de nanopartícules d'insulina liofilitzades amb manitol; (b) Imatge SEM de nanopartícules d'insulina assecades per polvorització sense manitol; (c) Imatges SEM de nanopartícules d'insulina assecades per polvorització sense manitol.
A més, es van observar precipitats a les nanopartícules d'insulina reconstituïdes assecades per polvorització amb manitol i liofilitzades (Fig. S2). Això pot ser causat per partícules grans que no es suspenen correctament a l'aigua. Tots els resultats anteriors demostren que la tècnica d'assecat per polvorització pot protegir les nanopartícules d'insulina de la deshidratació i que es poden obtenir càrregues elevades de nanopartícules d'insulina sense cap farciment ni crioprotector.
La retenció d'insulina es va provar en un medi de pH = 2,5 amb pepsina, tripsina i α-quimotripsina per demostrar la capacitat protectora de les nanopartícules contra la digestió enzimàtica després de la deshidratació. La retenció d'insulina de les nanopartícules deshidratades es va comparar amb la de les nanopartícules acabades de preparar, i la insulina lliure es va utilitzar com a control negatiu. En aquest estudi, la insulina lliure va mostrar una eliminació ràpida d'insulina en 4 h en els tres tractaments enzimàtics (Fig. 5a-c). En canvi, les proves d'eliminació d'insulina de les nanopartícules liofilitzades amb manitol i les nanopartícules assecades per polvorització amb o sense manitol van mostrar una protecció significativament més alta d'aquestes nanopartícules contra la digestió enzimàtica, que era similar a la de les nanopartícules d'insulina acabades de preparar (figura 1).5a-c). Amb l'ajuda de nanopartícules en pepsina, tripsina i α-quimotripsina, es va poder protegir més del 50%, 60% i 75% de la insulina en 4 h, respectivament (Fig. 5a-c). Aquesta protecció contra la insulina La capacitat pot augmentar la possibilitat d'una major absorció d'insulina al torrent sanguini25. Aquests resultats suggereixen que l'assecat per polvorització amb o sense manitol i la liofilització amb manitol poden preservar la capacitat protectora de la insulina de les nanopartícules després de la deshidratació.
Comportament de protecció i alliberament de nanopartícules d'insulina deshidratades: (a) protecció de la insulina en solució de pepsina; (b) protecció de la insulina en solució de tripsina; (c) protecció de la insulina per una solució d'α-quimotripsina; (d) El comportament d'alliberament de nanopartícules deshidratades en una solució de pH = 2,5; (e) el comportament d'alliberament de nanopartícules deshidratades en una solució de pH = 6,6; (f) el comportament d'alliberament de nanopartícules deshidratades en una solució de pH = 7,0.
Les nanopartícules d'insulina seca acabades de preparar i reconstituir es van incubar en diversos tampons (pH = 2,5, 6,6, 7,0) a 37 °C, simulant l'entorn de pH de l'estómac, el duodè i la part superior de l'intestí prim, per examinar l'efecte de la insulina sobre la resistència a la insulina. Comportament d'alliberament en diferents ambients. Fragment del tracte gastrointestinal. A pH = 2,5, les nanopartícules carregades d'insulina i les nanopartícules d'insulina seca resolubilitzades van mostrar un alliberament inicial en ràfegues durant la primera hora, seguit d'un alliberament lent durant les següents 5 hores (Fig. 5d). Aquest alliberament ràpid al principi és probablement el resultat d'una ràpida desorció superficial de molècules de proteïna que no estan completament immobilitzades a l'estructura interna de la partícula. A pH = 6,5, les nanopartícules carregades d'insulina i les nanopartícules d'insulina seca reconstituïdes van mostrar un alliberament suau i lent durant 6 h, ja que el pH de la solució de prova era similar al de la solució preparada amb nanopartícules (Fig. 5e). A pH = 7, les nanopartícules eren inestables i es van descompondre gairebé completament durant les dues primeres hores (Fig. 5f). Això es deu al fet que la desprotonació del quitosà es produeix a un pH més alt, cosa que resulta en una xarxa de polímers menys compacta i en l'alliberament d'insulina carregada.
A més, les nanopartícules d'insulina assecades per polvorització sense manitol van mostrar un perfil d'alliberament més ràpid que les altres nanopartícules deshidratades (Fig. 5d-f). Com s'ha descrit anteriorment, les nanopartícules d'insulina reconstituïdes assecades sense manitol van mostrar la mida de partícula més petita. Les partícules petites proporcionen una superfície més gran, de manera que la major part del fàrmac rellevant estarà a la superfície de la partícula o a prop d'aquesta, cosa que provocarà un alliberament ràpid del fàrmac26.
La citotoxicitat de les nanopartícules (NP) es va investigar mitjançant un assaig MTT. Com es mostra a la figura S4, es va trobar que totes les NP deshidratades no tenien cap efecte significatiu sobre la viabilitat cel·lular a concentracions de 50–500 μg/ml, cosa que suggereix que totes les NP deshidratades es poden utilitzar amb seguretat per assolir la finestra terapèutica.
El fetge és l'òrgan principal a través del qual la insulina exerceix les seves funcions fisiològiques. Les cèl·lules HepG2 són una línia cel·lular d'hepatoma humà que s'utilitza habitualment com a model de captació d'hepatòcits in vitro. Aquí, es van utilitzar cèl·lules HepG2 per avaluar la captació cel·lular de nanopartícules deshidratades mitjançant mètodes de liofilització i assecat per polvorització. Captació cel·lular mitjançant escaneig làser confocal mitjançant citometria de flux i visió després de diverses hores d'incubació amb insulina FITC lliure a una concentració de 25 μg/mL, nanopartícules carregades d'insulina FITC acabades de preparar i nanopartícules carregades d'insulina FITC deshidratades a concentracions iguals d'insulina. Es van realitzar observacions de microscòpia quantitativa (CLSM). Les nanopartícules liofilitzades sense manitol es van destruir durant la deshidratació i no es van avaluar en aquesta prova. Les intensitats de fluorescència intracel·lular de les nanopartícules carregades d'insulina acabades de preparar, les nanopartícules liofilitzades amb manitol i les nanopartícules assecades per polvorització amb i sense manitol (Fig. 6a) van ser de 4,3, 2,6, 2,4, i 4,1 vegades més alt que els lliures. Grup FITC-insulina, respectivament (Fig. 6b). Aquests resultats suggereixen que la insulina encapsulada és més potent en l'absorció cel·lular que la insulina lliure, principalment a causa de la mida més petita de les nanopartícules carregades d'insulina produïdes a l'estudi.
Captació de cèl·lules HepG2 després de 4 h d'incubació amb nanopartícules acabades de preparar i deshidratades: (a) Distribució de la captació d'insulina FITC per part de cèl·lules HepG2. (b) Mitjana geomètrica de les intensitats de fluorescència analitzades per citometria de flux (n = 3), *P < 0,05 en comparació amb la insulina lliure.
De la mateixa manera, les imatges CLSM van mostrar que les intensitats de fluorescència FITC de les nanopartícules carregades amb insulina FITC acabades de preparar i de les nanopartícules assecades per polvorització carregades amb insulina FITC (sense manitol) eren molt més fortes que les de les altres mostres (Fig. 6a). A més, amb l'addició de manitol, la major viscositat de la solució va augmentar la resistència a l'absorció cel·lular, donant lloc a una disminució de la proliferació d'insulina. Aquests resultats suggereixen que les nanopartícules assecades per polvorització sense manitol van mostrar la màxima eficiència d'absorció cel·lular perquè la seva mida de partícula era més petita que la de les nanopartícules liofilitzades després de la redissolució.
El quitosà (pes molecular mitjà 100 kDa, 75–85% desacetilat) es va comprar a Sigma-Aldrich (Oakville, Ontario, Canadà). El tripolifosfat de sodi (TPP) es va comprar a VWR (Radnor, Pennsilvània, EUA). La insulina humana recombinant utilitzada en aquest estudi va ser de Fisher Scientific (Waltham, MA, EUA). La insulina humana marcada amb isotiocianat de fluoresceïna (FITC) i el diclorhidrat de 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) es van comprar a Sigma-Aldrich (Oakville, Ontario, Canadà). La línia cel·lular HepG2 es va obtenir d'ATCC (Manassas, Virgínia, EUA). Tots els altres reactius eren de grau analític o cromatogràfic.
Prepareu una solució de CS d'1 mg/ml dissolent-la en aigua bidestilada (aigua DD) que contingui un 0,1% d'àcid acètic. Prepareu solucions d'1 mg/ml de TPP i insulina dissolent-les en aigua DD i un 0,1% d'àcid acètic, respectivament. La preemulsió es va preparar amb un homogeneïtzador d'alta velocitat Polytron PCU-2-110 (Brinkmann Ind. Westbury, NY, EUA). El procés de preparació és el següent: primer, s'afegeixen 2 ml de solució de TPP a 4 ml de solució d'insulina i la barreja s'agita durant 30 minuts i es barreja completament. A continuació, la solució barrejada es va afegir gota a gota a la solució de CS mitjançant una xeringa amb agitació a alta velocitat (10.000 rpm). Les mescles es van mantenir amb agitació a alta velocitat (15.000 rpm) en un bany de gel durant 30 minuts i es van ajustar a un pH determinat per obtenir nanopartícules d'insulina reticulades. Per homogeneïtzar encara més i reduir la mida de partícula de les nanopartícules d'insulina, es van sonicar per a 30 minuts més en un bany de gel utilitzant un sonicador tipus sonda (UP 200ST, Hielscher Ultrasonics, Teltow, Alemanya).
Les noves nanopartícules d'insulina (NSP) es van analitzar pel diàmetre mitjà Z, l'índex de polidispersitat (PDI) i el potencial zeta mitjançant mesures de dispersió dinàmica de la llum (DLS) amb un Litesizer 500 (Anton Paar, Graz, Àustria) diluint-les en aigua DD a 25 °C. La morfologia i la distribució de mida es van caracteritzar mitjançant un microscopi electrònic de transmissió (TEM) Hitachi H7600 (Hitachi, Tòquio, Japó), i les imatges es van analitzar posteriorment mitjançant el programari d'imatges Hitachi (Hitachi, Tòquio, Japó). Per avaluar l'eficiència d'encapsulació (EE) i la capacitat de càrrega (LC) de les nanopartícules d'insulina, les NP es van pipetejar en tubs d'ultrafiltració amb un tall de pes molecular de 100 kDa i es van centrifugar a 500 xg durant 30 min. La insulina no encapsulada al filtrat es va quantificar mitjançant un sistema HPLC Agilent 1100 Series (Agilent, Santa Clara, Califòrnia, EUA) que consta d'una bomba quaternària, un mostrejador automàtic, un escalfador de columna, i detector DAD. La insulina es va analitzar mitjançant una columna C18 (Zorbax, 3,5 μm, 4,6 mm × 150 mm, Agilent, EUA) i es va detectar a 214 nm. La fase mòbil era acetonitril i aigua, que contenia 0,1% de TFA, amb proporcions de gradient de 10/90 a 100/0, i es va córrer durant 10 minuts. La fase mòbil es va bombar a un cabal d'1,0 ml/min. La temperatura de la columna es va establir a 20 °C. Calculeu els percentatges d'EE i LC utilitzant les equacions (1) i (2).
Es van provar diverses ràtios CS/insulina que oscil·laven entre 2,0 i 4,0 per optimitzar les nanopartícules d'insulina. Es van afegir diferents quantitats de solució CS durant la preparació, mentre que la barreja insulina/TPP es va mantenir constant. Les nanopartícules d'insulina es van preparar en el rang de pH de 4,0 a 6,5 ​​controlant acuradament el pH de la barreja després d'afegir totes les solucions (insulina, TPP i CS). L'EE i la mida de partícula de les nanopartícules d'insulina es van avaluar a diferents valors de pH i ràtios de massa CS/insulina per optimitzar la formació de nanopartícules d'insulina.
Les nanopartícules d'insulina optimitzades es van col·locar al recipient d'alumini i es van cobrir amb un paper de seda atapeït amb cinta adhesiva. Posteriorment, els recipients cargolats es van col·locar en un liofilitzador Labconco FreeZone (Labconco, Kansas City, MO, EUA) equipat amb un assecador de safates. La temperatura i la pressió de buit es van establir a -10 °C i 0,350 Torr durant les primeres 2 hores, i a 0 °C i 0,120 Torr durant les 22 hores restants de les 24 hores per obtenir nanopartícules d'insulina seques.
Es va utilitzar l'assecador per polvorització Buchi Mini B-290 (BÜCHI, Flawil, Suïssa) per generar insulina encapsulada. Els paràmetres d'assecat seleccionats van ser: temperatura 100 °C, flux d'alimentació 3 L/min i flux de gas 4 L/min.
Les nanopartícules d'insulina abans i després de la deshidratació es van caracteritzar mitjançant espectroscòpia FTIR-ATR. Les nanopartícules deshidratades, així com la insulina lliure i el quitosà, es van analitzar mitjançant un espectrofotòmetre FTIR Spectrum 100 (PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, EUA) equipat amb un accessori universal de mostreig ATR (PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, EUA). Les mitjanes del senyal es van obtenir a partir de 16 escanejos a una resolució de 4 cm2 en el rang de freqüències de 4000-600 cm2.
La morfologia de les nanopartícules d'insulina seques es va avaluar mitjançant imatges SEM de nanopartícules d'insulina liofilitzades i assecades per polvorització capturades per un microscopi electrònic de rastreig de feix d'ions enfocat Helios NanoLab 650 (FIB-SEM) (FEI, Hillsboro, Oregon, EUA). El paràmetre principal utilitzat va ser el voltatge de 5 keV i el corrent de 30 mA.
Totes les nanopartícules d'insulina deshidratades es van redissoldre en aigua dd. La mida de les partícules, la PDI, l'EE i la LC es van tornar a provar utilitzant el mateix mètode esmentat anteriorment per avaluar la seva qualitat després de la deshidratació. L'estabilitat de les nanopartícules d'anhidroinsulina també es va mesurar provant les propietats de les nanopartícules després d'un emmagatzematge prolongat. En aquest estudi, totes les nanopartícules després de la deshidratació es van emmagatzemar a la nevera durant tres mesos. Després de tres mesos d'emmagatzematge, es van provar les nanopartícules per determinar la mida morfològica de les partícules, la PDI, l'EE i la LC.
Dissoldre 5 mL de nanopartícules reconstituïdes en 45 mL que continguin fluid gàstric simulat (pH 1,2, que conté 1% de pepsina), fluid intestinal (pH 6,8, que conté 1% de tripsina) o solució de quimotripsina (100 g/mL, en tampó fosfat, pH 7,8) per avaluar l'eficàcia de la insulina en la protecció de les nanopartícules després de la deshidratació. Es van incubar a 37 °C amb una velocitat d'agitació de 100 rpm. Es van recollir 500 μL de la solució en diferents moments i la concentració d'insulina es va determinar mitjançant HPLC.
El comportament d'alliberament in vitro de nanopartícules d'insulina acabades de preparar i deshidratades es va provar mitjançant el mètode de la bossa de diàlisi (límit de pes molecular de 100 kDa, Spectra Por Inc.). Les nanopartícules seques acabades de preparar i reconstituir es van dialitzar en fluids a pH 2,5, pH 6,6 i pH 7,0 (solució salina tamponada amb fosfat 0,1 M, PBS) per simular l'entorn de pH de l'estómac, el duodè i la part superior de l'intestí prim, respectivament. Totes les mostres es van incubar a 37 °C amb agitació contínua a 200 rpm. Aspireu el fluid fora de la bossa de diàlisi de 5 mL en els següents temps: 0,5, 1, 2, 3, 4 i 6 h, i reposeu immediatament el volum amb dialisat fresc. La contaminació per insulina en el fluid es va analitzar mitjançant HPLC i la taxa d'alliberament d'insulina de les nanopartícules es va calcular a partir de la relació entre la insulina lliure alliberada i la insulina total encapsulada a les nanopartícules (Equació 3).
Les cèl·lules de la línia cel·lular de carcinoma hepatocel·lular humà HepG2 es van cultivar en plaques de 60 mm de diàmetre utilitzant el medi Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) que contenia un 10% de sèrum fetal boví, 100 UI/mL de penicil·lina i 100 μg/mL d'estreptomicina29. Els cultius es van mantenir a 37 °C, 95% d'humitat relativa i 5% de CO2. Per als assaigs de captació, les cèl·lules HepG2 es van sembrar a 1 × 105 cèl·lules/ml en un sistema de portaobjectes de cambra Nunc Lab-Tek de 8 pous (Thermo Fisher, NY, EUA). Per als assaigs de citotoxicitat, es van sembrar en plaques de 96 pous (Corning, NY, EUA) a una densitat de 5 × 104 cèl·lules/ml.
L'assaig MTT es va utilitzar per avaluar la citotoxicitat de nanopartícules d'insulina acabades de preparar i deshidratades30. Les cèl·lules HepG2 es van sembrar en plaques de 96 pous a una densitat de 5 × 104 cèl·lules/mL i es van cultivar durant 7 dies abans de la prova. Les nanopartícules d'insulina es van diluir a diverses concentracions (de 50 a 500 μg/mL) en medi de cultiu i després es van administrar a les cèl·lules. Després de 24 hores d'incubació, les cèl·lules es van rentar 3 vegades amb PBS i es van incubar amb un medi que contenia 0,5 mg/ml de MTT durant 4 hores més. La citotoxicitat es va avaluar mesurant la reducció enzimàtica de MTT de tetrazoli groc a formazan porpra a 570 nm utilitzant un lector de plaques espectrofotòmetre Tecan infinite M200 pro (Tecan, Männedorf, Suïssa).
L'eficiència d'absorció cel·lular de les nanopartícules es va provar mitjançant microscòpia confocal d'escombratge làser i anàlisi de citometria de flux. Cada pou del sistema de portaobjectes de cambra Nunc Lab-Tek es va tractar amb insulina FITC lliure, nanopartícules carregades d'insulina FITC i es van reconstituir 25 μg/mL de nanopartícules d'insulina FITC deshidratades a la mateixa concentració i es van incubar durant 4 hores. Les cèl·lules es van rentar 3 vegades amb PBS i es van fixar amb paraformaldehid al 4%. Els nuclis es van tenyir amb 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI). La localització de la insulina es va observar mitjançant un microscopi confocal d'escombratge làser/dos fotons Olympus FV1000 (Olympus, Shinjuku City, Tòquio, Japó). Per a l'anàlisi de citometria de flux, es van afegir les mateixes concentracions de 10 μg/mL d'insulina FITC lliure, nanopartícules carregades d'insulina FITC i nanopartícules d'insulina FITC deshidratades resolubilitzades. Plaques de 96 pous sembrades amb cèl·lules HepG2 i incubades durant 4 hores. Després de 4 h d'incubació, les cèl·lules es van retirar i es van rentar 3 vegades amb FBS. Es van analitzar 5 × 104 cèl·lules per mostra amb un citòmetre de flux BD LSR II (BD, Franklin Lakes, Nova Jersey, Estats Units).
Tots els valors s'expressen com a mitjana ± desviació estàndard. Les comparacions entre tots els grups es van avaluar mitjançant ANOVA unidireccional o prova t d'IBM SPSS Statistics 26 per a Mac (IBM, Endicott, Nova York, EUA) i es va considerar estadísticament significatiu un valor de p < 0,05.
Aquest estudi demostra la flexibilitat i la capacitat de l'assecat per polvorització per deshidratar nanopartícules de quitosà/TPP/insulina reticulades amb una millor reconstitució en comparació amb els mètodes estàndard de liofilització que utilitzen agents de volum o crioprotectors, amb una capacitat i una major capacitat de càrrega. Les nanopartícules d'insulina optimitzades van produir una mida mitjana de partícula de 318 nm i una eficiència d'encapsulació del 99,4%. Els resultats de SEM i FTIR després de la deshidratació van mostrar que l'estructura esfèrica només es mantenia en nanopartícules assecades per polvorització amb i sense manitol i liofilitzades amb manitol, però les nanopartícules liofilitzades sense manitol es van descompondre durant la deshidratació. En la prova de capacitat de reconstitució, les nanopartícules d'insulina assecades per polvorització sense manitol van mostrar la mida mitjana de partícula més petita i la càrrega més alta després de la reconstitució. Els comportaments d'alliberament de totes aquestes nanopartícules deshidratades van mostrar que es van alliberar ràpidament en solucions de pH = 2,5 i pH = 7, i molt estables en solucions de pH = 6,5. En comparació amb altres nanopartícules deshidratades redissoltes, les nanopartícules L'assecat per polvorització sense manitol va mostrar l'alliberament més ràpid. Aquest resultat és coherent amb l'observat en l'assaig d'absorció cel·lular, ja que les nanopartícules assecades per polvorització en absència de manitol van mantenir gairebé completament l'eficiència d'absorció cel·lular de les nanopartícules acabades de preparar. Aquests resultats suggereixen que les nanopartícules d'insulina seques preparades per assecat per polvorització sense manitol són més adequades per a un processament posterior en altres formes de dosificació anhidres, com ara comprimits orals o pel·lícules bioadhesives.
A causa de problemes de propietat intel·lectual, els conjunts de dades generats i/o analitzats durant l'estudi actual no estan disponibles públicament, però estan disponibles a través dels respectius autors si es sol·liciten de manera raonable.
Kagan, A. Diabetis tipus 2: orígens socials i científics, complicacions mèdiques i implicacions per als pacients i altres persones (McFarlane, 2009).
Singh, AP, Guo, Y., Singh, A., Xie, W. i Jiang, P. El desenvolupament de l'encapsulació d'insulina: és possible ara l'administració oral? J. Pharmacy.bio-pharmacy.reservoir.1, 74–92 (2019).
Wong, CY, Al-Salami, H. i Dass, CR Avenços recents en sistemes d'administració oral de liposomes carregats d'insulina per al tractament de la diabetis. Interpretació. J. Pharmacy. 549, 201–217 (2018).