Gràcies per visitar Nature.com. La versió del navegador que esteu utilitzant té compatibilitat limitada amb CSS. Per obtenir els millors resultats, us recomanem que utilitzeu una versió més recent del vostre navegador (o que desactiveu el mode de compatibilitat a l'Internet Explorer). Mentrestant, per garantir una assistència contínua, mostrem el lloc web sense estils ni JavaScript.
L'àcid propiònic (PPA) s'utilitza per estudiar el paper de la disfunció mitocondrial en trastorns del neurodesenvolupament com el trastorn de l'espectre autista. Se sap que el PPA interromp la biogènesi, el metabolisme i la renovació mitocondrials. Tanmateix, els efectes del PPA sobre la dinàmica, la fissió i la fusió mitocondrials continuen sent problemàtics a causa de la complexa naturalesa temporal d'aquests mecanismes. Aquí, utilitzem tècniques d'imatge quantitatives complementàries per investigar com el PPA afecta l'ultraestructura, la morfologia i la dinàmica mitocondrials en cèl·lules SH-SY5Y semblants a les neurones. El PPA (5 mM) va causar una disminució significativa de l'àrea mitocondrial (p < 0,01), el diàmetre i la circumferència de Feret (p < 0,05) i l'àrea 2 (p < 0,01). L'anàlisi del localitzador d'esdeveniments mitocondrials va mostrar un augment significatiu (p < 0,05) en els esdeveniments de fissió i fusió, mantenint així la integritat de la xarxa mitocondrial en condicions d'estrès. A més, l'expressió d'ARNm de cMYC (p < 0,0001), NRF1 (p < 0,01), TFAM (p < 0,05), STOML2 (p < 0,0001) i OPA1 (p < 0,05) es va reduir significativament. 01). Això il·lustra la remodelació de la morfologia, la biogènesi i la dinàmica mitocondrials per mantenir la funció en condicions d'estrès. Les nostres dades proporcionen nous coneixements sobre els efectes del PPA en la dinàmica mitocondrial i destaquen la utilitat de les tècniques d'imatge per estudiar els mecanismes reguladors complexos implicats en les respostes a l'estrès mitocondrial.
Els mitocondris són participants integrals en una varietat de funcions cel·lulars més enllà dels seus papers típics en la producció d'energia i la biosíntesi. El metabolisme mitocondrial és un regulador clau de la senyalització del calci, l'homeòstasi metabòlica i redox, la senyalització inflamatòria, les modificacions epigenètiques, la proliferació cel·lular, la diferenciació i la mort cel·lular programada1. En particular, el metabolisme mitocondrial és crític per al desenvolupament, la supervivència i la funció neuronal i està àmpliament implicat en diverses manifestacions de neuropatologia2,3,4.
Durant l'última dècada, l'estat metabòlic ha emergit com a regulador central de la neurogènesi, la diferenciació, la maduració i la plasticitat5,6. Recentment, la morfologia i la dinàmica mitocondrials s'han convertit en components particularment importants de la mitosi, un procés dinàmic que manté un conjunt de mitocondris sans dins de les cèl·lules. La dinàmica mitocondrial està regulada per vies interdependents complexes que van des de la biogènesi i la bioenergètica mitocondrial fins a la fissió, la fusió, el transport i la depuració mitocondrial7,8. La interrupció de qualsevol d'aquests mecanismes integradors perjudica el manteniment de xarxes mitocondrials sanes i té profundes conseqüències funcionals per al neurodesenvolupament9,10. De fet, la desregulació de la dinàmica mitocondrial s'observa en molts trastorns psiquiàtrics, neurodegeneratius i del neurodesenvolupament, inclosos els trastorns de l'espectre autista (TEA)11,12.
El TEA és un trastorn del neurodesenvolupament heterogeni amb una arquitectura genètica i epigenètica complexa. L'heretabilitat del TEA és indiscutible, però l'etiologia molecular subjacent continua sent poc coneguda. L'acumulació de dades de models preclínics, estudis clínics i conjunts de dades moleculars multiòmiques proporciona proves creixents de disfunció mitocondrial en el TEA13,14. Anteriorment, vam realitzar una prova de metilació de l'ADN a nivell del genoma en una cohort de pacients amb TEA i vam identificar gens metilats diferencialment agrupats al llarg de les vies metabòliques mitocondrials15. Posteriorment, vam informar de la metilació diferencial dels reguladors centrals de la biogènesi i la dinàmica mitocondrial, que es va associar amb un augment del nombre de còpies de l'ADNmt i un perfil metabòlic urinari alterat en el TEA16. Les nostres dades proporcionen proves creixents que la dinàmica mitocondrial i l'homeòstasi tenen un paper central en la fisiopatologia del TEA. Per tant, millorar la comprensió mecanística de la relació entre la dinàmica, la morfologia i la funció mitocondrials és un objectiu clau de la investigació en curs sobre malalties neurològiques caracteritzades per una disfunció mitocondrial secundària.
Sovint s'utilitzen tècniques moleculars per estudiar el paper de gens específics en les respostes a l'estrès mitocondrial. Tanmateix, aquest enfocament pot estar limitat per la naturalesa multifacètica i temporal dels mecanismes de control mitòtic. A més, l'expressió diferencial dels gens mitocondrials és un indicador indirecte dels canvis funcionals, sobretot perquè normalment només s'analitza un nombre limitat de gens. Per tant, s'han proposat mètodes més directes per estudiar la funció mitocondrial i la bioenergètica17. La morfologia mitocondrial està estretament relacionada amb la dinàmica mitocondrial. La forma, la connectivitat i l'estructura mitocondrials són fonamentals per a la producció d'energia i la supervivència mitocondrial i cel·lular5,18. A més, els diversos components de la mitosi se centren en els canvis en la morfologia mitocondrial, que poden servir com a punts finals útils de la disfunció mitocondrial i proporcionar una base per a estudis mecanístics posteriors.
La morfologia mitocondrial es pot observar directament mitjançant microscòpia electrònica de transmissió (TEM), cosa que permet un estudi detallat de l'ultraestructura cel·lular. La TEM visualitza directament la morfologia, la forma i l'estructura de les crestes mitocondrials a la resolució de mitocondris individuals, en lloc de basar-se únicament en la transcripció gènica, l'expressió de proteïnes o els paràmetres funcionals mitocondrials en poblacions cel·lulars17,19,20. A més, la TEM facilita l'estudi de les interaccions entre els mitocondris i altres orgànuls, com ara el reticle endoplasmàtic i els autofagosomes, que tenen un paper clau en la funció mitocondrial i l'homeòstasi21,22. Per tant, això fa que la TEM sigui un bon punt de partida per estudiar la disfunció mitocondrial abans de centrar-se en vies o gens específics. A mesura que la funció mitocondrial esdevé cada cop més rellevant per a la neuropatologia, hi ha una clara necessitat de poder estudiar directament i quantitativament la morfologia i la dinàmica mitocondrial en models neuronals in vitro.
En aquest article, examinem la dinàmica mitocondrial en un model neuronal de disfunció mitocondrial en el trastorn de l'espectre autista. Anteriorment vam informar sobre la metilació diferencial de la propionil-CoA carboxilasa beta (PCCB) en ASD15, una subunitat de l'enzim propionil-CoA carboxilasa mitocondrial PCC. Se sap que la desregulació del PCC causa una acumulació tòxica de derivats de propionil, inclòs l'àcid propiònic (PPA)23,24,25. S'ha demostrat que el PPA interromp el metabolisme neuronal i altera el comportament in vivo i és un model animal establert per estudiar els mecanismes del neurodesenvolupament implicats en el TEA26,27,28. A més, s'ha informat que el PPA interromp el potencial de membrana mitocondrial, la biogènesi i la respiració in vitro i s'ha utilitzat àmpliament per modelar la disfunció mitocondrial en neurones29,30. Tanmateix, l'impacte de la disfunció mitocondrial induïda per PPA en la morfologia i la dinàmica mitocondrial encara no es coneix bé.
Aquest estudi utilitza tècniques d'imatge complementàries per quantificar els efectes del PPA en la morfologia, la dinàmica i la funció mitocondrials en cèl·lules SH-SY5Y. Primer, vam desenvolupar un mètode TEM per visualitzar els canvis en la morfologia i l'ultraestructura mitocondrials17,31,32. Donada la naturalesa dinàmica dels mitocondris33, també vam utilitzar l'anàlisi del localitzador d'esdeveniments mitocondrials (MEL) per quantificar els canvis en l'equilibri entre els esdeveniments de fissió i fusió, el nombre i el volum mitocondrials sota estrès PPA. Finalment, vam examinar si la morfologia i la dinàmica mitocondrials estan associades amb canvis en l'expressió de gens implicats en la biogènesi, la fissió i la fusió. En conjunt, les nostres dades il·lustren el repte d'elucidar la complexitat dels mecanismes que regulen la dinàmica mitocondrial. Destaquem la utilitat del TEM en l'estudi de la morfologia mitocondrial com a punt final convergent mesurable de la mitosi en cèl·lules SH-SY5Y. A més, destaquem que les dades TEM proporcionen la informació més rica quan es combinen amb tècniques d'imatge que també capturen esdeveniments dinàmics en resposta a l'estrès metabòlic. Una caracterització més detallada dels mecanismes reguladors moleculars que donen suport a la mitosi de les cèl·lules neuronals podria proporcionar informació important sobre el component mitocondrial del sistema nerviós i les malalties neurodegeneratives.
Per induir estrès mitocondrial, les cèl·lules SH-SY5Y es van tractar amb PPA utilitzant 3 mM i 5 mM de propionat de sodi (NaP). Abans del TEM, les mostres es van sotmetre a preparació criogènica de mostres mitjançant congelació a alta pressió i congelació (Fig. 1a). Vam desenvolupar una cadena de proves automatitzada d'anàlisi d'imatges mitocondrials per mesurar vuit paràmetres morfològics de poblacions mitocondrials en tres rèpliques biològiques. Vam trobar que el tractament amb PPA va canviar significativament quatre paràmetres: àrea 2, àrea, perímetre i diàmetre de Feret (Fig. 1b-e). L'àrea 2 va disminuir significativament amb el tractament amb PPA de 3 mM i 5 mM (p = 0,0183 i p = 0,002, respectivament) (Fig. 1b), mentre que l'àrea (p = 0,003), el perímetre (p = 0,0106) i el diàmetre de Feret han disminuït significativament. Hi va haver una reducció significativa (p = 0,0172) en el grup de tractament de 5 mM en comparació amb el grup de control (Fig. 1c-e). Reduccions significatives en l'àrea i la circumferència van mostrar que les cèl·lules tractades amb 5 mM de PPA tenien mitocondris més petits i arrodonits, i que aquests mitocondris eren menys allargats que els de les cèl·lules de control. Això també és coherent amb una disminució significativa del diàmetre de Feret, un paràmetre independent que indica una disminució de la distància més gran entre les vores de les partícules. Es van observar canvis en l'ultraestructura de les crestes: les crestes es van tornar menys pronunciades sota la influència de l'estrès del PPA (Fig. 1a, panell B). Tanmateix, no totes les imatges reflectien clarament l'ultraestructura de les crestes, per la qual cosa no es va dur a terme una anàlisi quantitativa d'aquests canvis. Aquestes dades de TEM poden reflectir tres possibles escenaris: (1) el PPA millora la fissió o inhibeix la fusió, fent que els mitocondris existents es redueixin de mida; (2) una biogènesi millorada crea mitocondris nous i més petits o (3) indueix tots dos mecanismes simultàniament. Tot i que aquestes condicions no es poden distingir mitjançant TEM, canvis morfològics significatius indiquen canvis en l'homeòstasi i la dinàmica mitocondrial sota l'estrès del PPA. Posteriorment, vam explorar paràmetres addicionals per caracteritzar més a fons aquestes dinàmiques i els possibles mecanismes subjacents.
L'àcid propiònic (PPA) remodela la morfologia mitocondrial. (a) Imatges representatives de microscòpia electrònica de transmissió (TEM) que mostren que la mida mitocondrial disminueix i els mitocondris es tornen més petits i arrodonits amb l'augment del tractament amb PPA; 0 mM (sense tractar), 3 mM i 5 mM, respectivament. Les fletxes vermelles indiquen els mitocondris. (b-e) Les cèl·lules SH-SY5Y tractades amb PPA durant 24 h es van preparar per a TEM i els resultats es van analitzar mitjançant Fiji/ImageJ. Quatre dels vuit paràmetres van mostrar diferències significatives entre les cèl·lules de control (sense tractar, 0 mM PPA) i les tractades (3 mM i 5 mM PPA). (b) Regió 2, (c) Àrea, (d) Perímetre, (e) Diàmetre de Feret. Es van utilitzar l'anàlisi unidireccional de la variància (control vs. tractament) i la prova de comparació múltiple de Dunnett per determinar diferències significatives (p < 0,05). Els punts de dades representen el valor mitocondrial mitjà per a cada cèl·lula individual, i les barres d'error representen la mitjana ± SEM. Les dades mostrades representen n = 3, almenys 24 cèl·lules per rèplica; es van analitzar un total de 266 imatges; * indica p < 0,05, ** indica p < 0,01.
Per caracteritzar més a fons com respon la dinàmica mitocondrial al PPA, vam tenyir els mitocondris amb èster etílic de tetrametilrodamina (TMRE) i vam utilitzar microscòpia de lapse de temps i anàlisi MEL per localitzar i quantificar els mitocondris després de 24 hores a 3 i 5 mM de PPA. Tractament d'esdeveniments de fissió i fusió. (Fig. 2a). Després de l'anàlisi MEL, els mitocondris es van analitzar més a fons per quantificar el nombre d'estructures mitocondrials i el seu volum mitjà. Vam observar un augment petit però significatiu en el nombre d'esdeveniments de fissió que es van produir a 3 mM [4,9 ± 0,3 (p < 0,05)] en comparació amb la fissió [5,6 ± 0,3 (p < 0,05)] i els esdeveniments de fusió [5,4 ± 0,5 (p < 0,05)] i fusió [5,4 ± 0,5 (p < 0,05)] (0,05)] <0,05)] van augmentar significativament a 5 mM en comparació amb el control (Fig. 3b). El nombre de mitocondris va augmentar significativament tant a 3 [32,6 ± 2,1 (p < 0,05)] com a 5 mM [34,1 ± 2,2 (p < 0,05)] (Fig. 3c), mentre que el volum mitjà de cada estructura mitocondrial es va mantenir sense canvis (Fig. 3c). 3d). En conjunt, això suggereix que la remodelació de la dinàmica mitocondrial serveix com a resposta compensatòria que manté amb èxit la integritat de la xarxa mitocondrial. L'augment del nombre d'esdeveniments de fissió a 3 mM de PPA suggereix que l'augment del nombre de mitocondris es deu en part a la fissió mitocondrial, però atès que el volum mitocondrial mitjà roman essencialment sense canvis, no es pot descartar la biogènesi com a resposta compensatòria addicional. Tanmateix, aquestes dades són consistents amb les estructures mitocondrials més petites i rodones observades per TEM i també demostren canvis significatius en la dinàmica mitocondrial induïda per PPA.
L'àcid propiònic (PPA) indueix una remodelació mitocondrial dinàmica per mantenir la integritat de la xarxa. Les cèl·lules SH-SY5Y es van cultivar, es van tractar amb 3 i 5 mM de PPA durant 24 hores i es van tenyir amb TMRE i Hoechst 33342 seguit d'una anàlisi MEL. (a) Imatges representatives de microscòpia de lapse de temps que mostren projeccions de color i intensitat màxima binaritzades en el temps 2 (t2) per a cada condició. Les regions seleccionades indicades a cada imatge binària es milloren i es mostren en 3D en tres marcs temporals diferents (t1-t3) per il·lustrar la dinàmica al llarg del temps; els esdeveniments de fusió es destaquen en verd; els esdeveniments de fissió es destaquen en verd. Es mostren en vermell. (b) Nombre mitjà d'esdeveniments dinàmics per condició. (c) Nombre mitjà d'estructures mitocondrials per cèl·lula. (d) Volum mitjà (µm3) de cada estructura mitocondrial per cèl·lula. Les dades mostrades són representatives de n = 15 cèl·lules per grup de tractament. Les barres d'error que es mostren representen la mitjana ± SEM, barra d'escala = 10 μm, * p < 0,05.
L'àcid propiònic (PPA) causa la supressió transcripcional de gens associats amb la dinàmica mitocondrial. Les cèl·lules SH-SY5Y es van tractar amb 3 i 5 mM de PPA durant 24 h. La quantificació gènica relativa es va realitzar mitjançant RT-qPCR i es va normalitzar a B2M. Gens de biogènesi mitocondrial (a) cMYC, (b) TFAM, (c) NRF1 i (d) NFE2L2. Gens de fusió i fissió mitocondrial (e) STOML2, (f) OPA1, (g) MFN1, (h) MFN2 i (i) DRP1. Les diferències significatives (p < 0,05) es van provar mitjançant ANOVA unidireccional (control vs. tractament) i la prova de comparació múltiple de Dunnett: * indica p < 0,05, ** indica p < 0,01 i **** indica p < 0,0001. Les barres representen l'expressió mitjana ± SEM. Les dades mostrades representen n = 3 (STOML2, OPA1, TFAM), n = 4 (cMYC, NRF1, NFE2L2) i n = 5 (MFN1, MFN2, DRP1) rèpliques biològiques.
Les dades de les anàlisis TEM i MEL juntes indiquen que el PPA altera la morfologia i la dinàmica mitocondrial. Tanmateix, aquestes tècniques d'imatge no proporcionen informació sobre els mecanismes subjacents que impulsen aquests processos. Per tant, vam examinar l'expressió d'ARNm de nou reguladors clau de la dinàmica mitocondrial, la biogènesi i la mitosi en resposta al tractament amb PPA. Vam quantificar l'oncogen del mieloma cel·lular (cMYC), el factor respiratori nuclear (NRF1), el factor de transcripció mitocondrial 1 (TFAM), el factor de transcripció similar a NFE2 BZIP (NFE2L2), la proteïna similar a la gastrina 2 (STOML2), l'atròfia del nervi òptic 1 (OPA1), la mitofusina 1 (MFN1), la mitofusina 2 (MFN2) i la proteïna relacionada amb la dinamina 1 (DRP1) després de 24 hores de tractament amb 3 mM i 5 mM de PPA. Vam observar un tractament amb PPA de 3 mM (p = 0,0053, p = 0,0415 i p < 0,0001, respectivament) i 5 mM (p = 0,0031, p = 0,0233, p < 0,0001). (Fig. 3a-c). La disminució de l'expressió de l'ARNm va ser dependent de la dosi: l'expressió de cMYC, NRF1 i TFAM va disminuir 5,7, 2,6 i 1,9 vegades a 3 mM, respectivament, i 11,2, 3 i 2,2 vegades a 5 mM. En canvi, el gen de biogènesi redox central NFE2L2 no es va alterar a cap concentració de PPA, tot i que es va observar una tendència similar dependent de la dosi de disminució de l'expressió (Fig. 3d).
També vam examinar l'expressió de gens clàssics implicats en la regulació de la fissió i la fusió. Es creu que STOML2 està implicat en la fusió, la mitofàgia i la biogènesi, i la seva expressió es va reduir significativament (p < 0,0001) en 3 mM (canvi de 2,4 vegades) i 5 mM (canvi de 2,8 vegades) de PPA (Fig. 1). 3d). De manera similar, l'expressió del gen de fusió OPA1 va disminuir a 3 mM (canvi d'1,6 vegades) i 5 mM (canvi d'1,9 vegades) de PPA (p = 0,006 i p = 0,0024, respectivament) (Fig. 3f). Tanmateix, no vam trobar diferències significatives en l'expressió dels gens de fusió MFN1, MFN2 o el gen de fissió DRP1 sota estrès PPA de 24 h (Fig. 3g-i). A més, vam trobar que els nivells de quatre proteïnes de fusió i fissió (OPA1, MFN1, MFN2 i DRP1) no van canviar en les mateixes condicions (Fig. 4a-d). És important tenir en compte que aquestes dades reflecteixen un únic punt en el temps i poden no reflectir canvis en l'expressió de proteïnes o els nivells d'activitat durant les primeres etapes de l'estrès PPA. Tanmateix, reduccions significatives en l'expressió de cMYC, NRF1, TFAM, STOML2 i OPA1 indiquen una desregulació transcripcional significativa del metabolisme, la biogènesi i la dinàmica mitocondrials. A més, aquestes dades destaquen la utilitat de les tècniques d'imatge per estudiar directament els canvis en l'estat final de la funció mitocondrial.
Els nivells de proteïna de fusió i factor de fissió no van canviar després del tractament amb àcid propiònic (PPA). Les cèl·lules SH-SY5Y es van tractar amb 3 i 5 mM de PPA durant 24 h. Els nivells de proteïna es van quantificar mitjançant anàlisi de Western blot i els nivells d'expressió es van normalitzar a la proteïna total. Es mostra l'expressió mitjana de la proteïna i els Western blots representatius de la proteïna diana i total. a – OPA1, b – MFN1, c – MFN2, d – DRP1. Les barres representen la mitjana ± SEM i les dades mostrades són representatives de n = 3 rèpliques biològiques. Es van realitzar comparacions múltiples (p < 0,05) mitjançant l'anàlisi de la variància unidireccional i la prova de Dunnett. El gel i el blot originals es mostren a la Figura S1.
La disfunció mitocondrial s'associa amb malalties multisistèmiques que van des de malalties metabòliques, cardiovasculars i musculars fins a malalties neurològiques1,10. Moltes malalties neurodegeneratives i neurodegeneratives estan associades amb la disfunció mitocondrial, cosa que destaca la importància d'aquests orgànuls al llarg de la vida del cervell. Aquestes malalties inclouen la malaltia de Parkinson, la malaltia d'Alzheimer i el TEA3,4,18. Tanmateix, l'accés al teixit cerebral per estudiar aquestes malalties és difícil, especialment a nivell mecanístic, cosa que fa que els sistemes de models cel·lulars siguin una alternativa necessària. En aquest estudi, utilitzem un sistema de models cel·lulars que utilitza cèl·lules SH-SY5Y tractades amb PPA per recapitular la disfunció mitocondrial observada en malalties neuronals, particularment trastorns de l'espectre autista. L'ús d'aquest model PPA per estudiar la dinàmica mitocondrial de les neurones pot proporcionar informació sobre l'etiologia del TEA.
Vam explorar la possibilitat d'utilitzar TEM per visualitzar els canvis en la morfologia mitocondrial. És important tenir en compte que el TEM s'ha d'utilitzar correctament per maximitzar la seva eficàcia. La preparació de crioespècimens permet una millor preservació de les estructures neuronals fixant simultàniament els components cel·lulars i reduint la formació d'artefactes34. D'acord amb això, vam observar que les cèl·lules SH-SY5Y semblants a les neurones tenien orgànuls subcel·lulars intactes i mitocondris allargats (Fig. 1a). Això destaca la utilitat de les tècniques de preparació criogènica per estudiar la morfologia mitocondrial en models de cèl·lules neuronals. Tot i que les mesures quantitatives són crítiques per a l'anàlisi objectiva de les dades de TEM, encara no hi ha consens sobre quins paràmetres específics s'han de mesurar per confirmar els canvis morfològics mitocondrials. Basant-nos en un gran nombre d'estudis que han examinat quantitativament la morfologia mitocondrial17,31,32, vam desenvolupar una cadena automatitzada d'anàlisi d'imatges mitocondrials que mesura vuit paràmetres morfològics, és a dir: àrea, àrea2, relació d'aspecte, perímetre, circularitat, grau, diàmetre de Feret i rodonesa.
Entre ells, el PPA va reduir significativament l'àrea 2, l'àrea, el perímetre i el diàmetre de Feret (Fig. 1b-e). Això va mostrar que els mitocondris es van tornar més petits i arrodonits, la qual cosa és coherent amb estudis anteriors que mostren una disminució de l'àrea mitocondrial després de 72 hores d'estrès mitocondrial induït per PPA30. Aquestes característiques morfològiques poden indicar fissió mitocondrial, un procés necessari per segrestar components danyats de la xarxa mitocondrial per promoure la seva degradació a través de la mitofàgia35,36,37. D'altra banda, la disminució de la mida mitocondrial mitjana pot estar associada amb un augment de la biogènesi, que resulta en la formació de petits mitocondris naixents. L'augment de la fissió o biogènesi representa una resposta compensatòria per mantenir la mitosi contra l'estrès mitocondrial. Tanmateix, no es pot descartar la disminució del creixement mitocondrial, la fusió deteriorada o altres afeccions.
Tot i que les imatges d'alta resolució creades per TEM permeten determinar les característiques morfològiques a nivell de mitocondris individuals, aquest mètode produeix instantànies bidimensionals en un sol punt en el temps. Per estudiar les respostes dinàmiques a l'estrès metabòlic, vam tenyir els mitocondris amb TMRE i vam utilitzar microscòpia de lapse de temps amb anàlisi MEL, que permet la visualització 3D d'alt rendiment dels canvis a la xarxa mitocondrial al llarg del temps33,38. Vam observar canvis subtils però significatius en la dinàmica mitocondrial sota estrès PPA (Fig. 2). A 3 mM, el nombre d'esdeveniments de fissió va augmentar significativament, mentre que els esdeveniments de fusió es van mantenir iguals que en el control. Es va observar un augment en el nombre d'esdeveniments tant de fissió com de fusió a 5 mM de PPA, però aquests canvis van ser aproximadament proporcionals, cosa que suggereix que la cinètica de fissió i fusió arriba a l'equilibri a concentracions més altes (Fig. 2b). El volum mitocondrial mitjà es va mantenir sense canvis tant a 3 com a 5 mM de PPA, cosa que indica que es va preservar la integritat de la xarxa mitocondrial (Fig. 2d). Això reflecteix la capacitat de les xarxes mitocondrials dinàmiques per respondre a un estrès metabòlic lleu per mantenir eficaçment l'homeòstasi sense causar fragmentació de la xarxa. A 3 mM de PPA, l'augment de la fissió és suficient per promoure la transició cap a un nou equilibri, però es requereix una remodelació cinètica més profunda en resposta a l'estrès induït per concentracions més altes de PPA.
El nombre de mitocondris va augmentar a ambdues concentracions d'estrès de PPA, però el volum mitocondrial mitjà no va canviar significativament (Fig. 2c). Això pot ser degut a un augment de la biogènesi o a un augment de la divisió; tanmateix, en absència d'una disminució significativa del volum mitocondrial mitjà, és més probable que la biosíntesi augmenti. Tanmateix, les dades de la Figura 2 sí que donen suport a l'existència de dos mecanismes compensatoris: un augment del nombre d'esdeveniments de fissió, d'acord amb la regulació a l'alça de la fissió mitocondrial, i un augment del nombre d'esdeveniments, d'acord amb la biogènesi mitocondrial. En última instància, la compensació dinàmica per a l'estrès lleu pot consistir en processos simultanis que impliquen fissió, fusió, biogènesi i mitofàgia. Tot i que autors anteriors han demostrat que el PPA potencia la mitosi30,39 i la mitofàgia29, nosaltres proporcionem proves de remodelació de la dinàmica de fissió i fusió mitocondrial en resposta al PPA. Aquestes dades confirmen els canvis morfològics observats per TEM i proporcionen més informació sobre els mecanismes associats amb la disfunció mitocondrial induïda per PPA.
Com que ni l'anàlisi TEM ni la MEL van proporcionar proves directes dels mecanismes reguladors gènics subjacents als canvis morfològics observats, vam examinar l'expressió d'ARN de gens implicats en el metabolisme, la biogènesi i la dinàmica mitocondrials. El protooncogen cMYC és un factor de transcripció implicat en la regulació del metabolisme dels mitocondris, la glucòlisi, el metabolisme dels aminoàcids i els àcids grassos40. A més, se sap que el cMYC regula l'expressió de gairebé 600 gens mitocondrials implicats en la transcripció, la traducció i l'assemblatge complex mitocondrial, inclosos NRF1 i TFAM41. NRF1 i TFAM són dos reguladors centrals de la mitosi, que actuen aigües avall de PGC-1α per activar la replicació del mtDNA. Aquesta via s'activa mitjançant la senyalització d'AMPc i AMPK i és sensible a la despesa energètica i a l'estrès metabòlic. També vam examinar NFE2L2, un regulador redox de la biogènesi mitocondrial, per determinar si els efectes del PPA podrien estar mediats per l'estrès oxidatiu.
Tot i que l'expressió de NFE2L2 es va mantenir sense canvis, vam trobar una disminució consistent dependent de la dosi en l'expressió de cMYC, NRF1 i TFAM després de 24 h de tractament amb 3 mM i 5 mM de PPA (Fig. 3a-c). La regulació a la baixa de l'expressió de cMYC s'ha descrit anteriorment com a resposta a l'estrès mitocondrial42, i a l'inrevés, la regulació a la baixa de l'expressió de cMYC pot causar disfunció mitocondrial mitjançant la remodelació del metabolisme mitocondrial, la connectivitat de xarxa i la polarització de membrana43. Curiosament, el cMYC també participa en la regulació de la fissió i la fusió mitocondrial42,43 i se sap que augmenta la fosforilació de DRP1 i la localització mitocondrial durant la divisió cel·lular44, així com que media la remodelació morfològica mitocondrial en cèl·lules mare neuronals45. De fet, els fibroblasts deficients en cMYC presenten una mida mitocondrial reduïda, d'acord amb els canvis induïts per l'estrès del PPA43. Aquestes dades il·lustren una relació interessant però encara poc clara entre el cMYC i la dinàmica mitocondrial, proporcionant un objectiu interessant per a futurs estudis de remodelació induïda per l'estrès del PPA.
La reducció de NRF1 i TFAM és coherent amb el paper de cMYC com a activador transcripcional important. Aquestes dades també són coherents amb estudis previs en cèl·lules de càncer de còlon humà que mostren que el PPA va reduir l'expressió de l'ARNm de NRF1 a les 22 hores, cosa que es va associar amb la depleció d'ATP i un augment de ROS46. Aquests autors també van informar que l'expressió de TFAM va augmentar a les 8,5 hores però va tornar als nivells basals a les 22 hores. En canvi, Kim et al. (2019) van mostrar que l'expressió de l'ARNm de TFAM va disminuir significativament després de 4 hores d'estrès de PPA en cèl·lules SH-SY5Y; no obstant això, després de 72 hores, l'expressió de la proteïna TFAM va augmentar significativament i el nombre de còpies de mtDNA va augmentar significativament. Per tant, la disminució del nombre de gens de biogènesi mitocondrial que vam observar després de 24 hores no exclou la possibilitat que l'augment del nombre de mitocondris estigui associat amb l'activació de la biogènesi en moments anteriors. Estudis previs han demostrat que el PPA regula significativament a l'alça l'ARNm i la proteïna del PGC-1α en cèl·lules SH-SY5Y a les 4 hores 30 minuts, mentre que l'àcid propiònic millora la biogènesi mitocondrial en hepatòcits de vedella a través del PGC-1α a les 12 hores 39 minuts. Curiosament, el PGC-1α no només és un regulador transcripcional directe de NRF1 i TFAM, sinó que també s'ha demostrat que regula l'activitat de MFN2 i DRP1 mitjançant la regulació de la fissió i la fusió47. En conjunt, això destaca l'estret acoblament dels mecanismes que regulen les respostes compensatòries mitocondrials induïdes pel PPA. A més, les nostres dades reflecteixen una desregulació significativa de la regulació transcripcional de la biogènesi i el metabolisme sota estrès del PPA.
Els gens STOML2, OPA1, MFN1, MFN2 i DRP1 es troben entre els reguladors centrals de la fissió, la fusió i la dinàmica mitocondrial37,48,49. Hi ha molts altres gens implicats en la dinàmica mitocondrial, però, anteriorment s'ha descobert que STOML2, OPA1 i MFN2 estan metilats diferencialment en cohorts d'ASD,16 i diversos estudis independents han informat de canvis en aquests factors de transcripció en resposta a l'estrès mitocondrial50,51.52. L'expressió tant d'OPA1 com de STOML2 es va reduir significativament amb el tractament amb PPA de 3 mM i 5 mM (Fig. 3e, f). OPA1 és un dels reguladors clàssics de la fusió mitocondrial mitjançant la interacció directa amb MFN1 i 2 i juga un paper en la remodelació de les crestes i la morfologia mitocondrial53. El paper precís de STOML2 en la dinàmica mitocondrial encara no està clar, però l'evidència suggereix que juga un paper en la fusió mitocondrial, la biogènesi i la mitofàgia.
STOML2 està implicat en el manteniment de l'acoblament respiratori mitocondrial i la formació de complexos de la cadena respiratòria54,55 i s'ha demostrat que altera profundament les característiques metabòliques de les cèl·lules canceroses56. Els estudis han demostrat que STOML2 promou el potencial de membrana mitocondrial i la biogènesi mitjançant la interacció amb BAN i cardiolipina 55, 57, 58. A més, estudis independents han demostrat que la interacció entre STOML2 i PINK1 regula la mitofàgia59,60. Cal destacar que s'ha informat que STOML2 interactua directament amb MFN2 i l'estabilitza i també juga un paper important en l'estabilització de les isoformes llargues d'OPA1 mitjançant la inhibició de la proteasa responsable de la degradació d'OPA153,61,62. La reducció de l'expressió de STOML2 observada en les reaccions de PPA pot fer que aquestes proteïnes de fusió siguin més susceptibles a la degradació a través de vies dependents de la ubiquitina i el proteasoma48. Tot i que el paper precís de STOML2 i OPA1 en la resposta dinàmica al PPA no està clar, la disminució de l'expressió d'aquests gens de fusió (Figura 3) pot interrompre l'equilibri entre la fissió i la fusió i conduir a una disminució de la mida mitocondrial (Figura 3). 1).
D'altra banda, l'expressió de la proteïna OPA1 es va mantenir sense canvis després de 24 h, mentre que els nivells d'ARNm i proteïna de MFN1, MFN2 o DRP1 no van canviar significativament després del tractament amb PPA (Fig. 3g-i, Fig. 4). Això pot indicar que no hi ha canvis en la regulació d'aquests factors implicats en la fusió i fissió mitocondrials. Tanmateix, val la pena assenyalar que cadascun d'aquests quatre gens també està regulat per modificacions posttranscripcionals (PTM) que controlen l'activitat de les proteïnes. L'OPA1 té vuit variants d'empalmament alternatives que es tallen proteolíticament als mitocondris per produir dues isoformes diferents 63. L'equilibri entre les isoformes llargues i curtes determina en última instància el paper de l'OPA1 en la fusió mitocondrial i el manteniment de la xarxa mitocondrial 64. L'activitat de DRP1 està regulada per la fosforilació de la proteïna cinasa II dependent de calci/calmodulina (CaMKII), mentre que la degradació de DRP1 està regulada per ubiquitinació i SUMOilació 65. Finalment, tant DRP1 com MFN1/2 són GTPases, de manera que l'activitat pot estar influenciada per la taxa de producció de GTP als mitocondris 66. Per tant, tot i que l'expressió d'aquestes proteïnes roman constant, això pot no reflectir una activitat o localització proteica inalterada 67,68. De fet, els repertoris de proteïnes PTM existents sovint serveixen com a primera línia de defensa responsable de mediar les respostes agudes a l'estrès. En presència d'un estrès metabòlic moderat en el nostre model, és probable que el PTM promogui una major activitat de les proteïnes de fusió i fissió per restaurar suficientment la integritat mitocondrial sense requerir l'activació addicional d'aquests gens a nivell d'ARNm o proteïna.
En conjunt, les dades anteriors destaquen la regulació complexa i dependent del temps de la morfologia mitocondrial i els reptes d'elucidar aquests mecanismes. Per estudiar l'expressió gènica, primer cal identificar gens diana específics de la via. Tanmateix, les nostres dades mostren que els gens de la mateixa via no responen de la mateixa manera al mateix estrès. De fet, estudis previs han demostrat que diferents gens de la mateixa via poden presentar perfils de resposta temporal diferents30,46. A més, hi ha mecanismes posttranscripcionals complexos que interrompen la relació entre la transcripció i la funció gènica. Els estudis proteòmics poden proporcionar informació sobre l'impacte dels PTM i la funció de les proteïnes, però també plantegen reptes, com ara mètodes de baix rendiment, altes relacions senyal-soroll i mala resolució.
En aquest context, estudiar la morfologia mitocondrial mitjançant TEM i MEL té un gran potencial per abordar preguntes fonamentals sobre la relació entre la dinàmica i la funció mitocondrials i com això influeix en la malaltia. El més important és que el TEM proporciona un mètode directe per mesurar la morfologia mitocondrial com a punt final convergent de la disfunció i la dinàmica mitocondrial51. El MEL també proporciona un mètode directe per visualitzar esdeveniments de fissió i fusió en un entorn cel·lular tridimensional, permetent la quantificació de la remodelació mitocondrial dinàmica fins i tot en absència de canvis en l'expressió gènica33. Aquí destaquem la utilitat de les tècniques d'imatge mitocondrial en malalties mitocondrials secundàries. Aquestes malalties es caracteritzen típicament per un estrès metabòlic lleu crònic caracteritzat per una remodelació subtil de les xarxes mitocondrials en lloc d'un dany mitocondrial agut. Tanmateix, la compensació mitocondrial necessària per mantenir la mitosi sota estrès crònic té profundes conseqüències funcionals. En el context de la neurociència, una millor comprensió d'aquests mecanismes compensatoris pot proporcionar informació important sobre la neuropatologia pleiotròpica associada a la disfunció mitocondrial.
En definitiva, les nostres dades destaquen la utilitat de les tècniques d'imatge per comprendre les conseqüències funcionals de les complexes interaccions entre l'expressió gènica, les modificacions de proteïnes i l'activitat proteica que controlen la dinàmica mitocondrial neuronal. Vam utilitzar el PPA per modelar la disfunció mitocondrial en un model de cèl·lula neuronal per obtenir informació sobre el component mitocondrial del TEA. Les cèl·lules SH-SY5Y tractades amb PPA van mostrar canvis en la morfologia mitocondrial: els mitocondris es van tornar petits i rodons, i les crestes estaven mal definides quan es van observar mitjançant TEM. L'anàlisi MEL mostra que aquests canvis es produeixen simultàniament amb un augment dels esdeveniments de fissió i fusió per mantenir la xarxa mitocondrial en resposta a un estrès metabòlic lleu. A més, el PPA interromp significativament la regulació transcripcional del metabolisme i l'homeòstasi mitocondrial. Vam identificar cMYC, NRF1, TFAM, STOML2 i OPA1 com a reguladors mitocondrials clau interromputs per l'estrès del PPA i que poden tenir un paper en la mediació dels canvis induïts pel PPA en la morfologia i la funció mitocondrial. Calen estudis futurs per caracteritzar millor els canvis temporals induïts pel PPA en l'expressió gènica i l'activitat proteica, la localització i les modificacions posttraduccionals. Les nostres dades destaquen la complexitat i la interdependència dels mecanismes reguladors que medien la resposta a l'estrès mitocondrial i demostren la utilitat de la TEM i altres tècniques d'imatge per a estudis mecanístics més específics.
La línia cel·lular SH-SY5Y (ECACC, 94030304-1VL) es va adquirir a Sigma-Aldrich. Les cèl·lules SH-SY5Y es van cultivar en una barreja de nutrients Dulbecco's modified Eagle's medium/F-12 (DMEM/F-12) i L-glutamina (SC09411, ScienCell) en flascons de 25 cm2 suplementats amb un 20% de sèrum fetal boví (FBS) (10493106, ThermoFisher Scientific) i un 1% de penicil·lina-estreptomicina (P4333-20ML, Sigma-Aldrich) a 37 °C i un 5% de CO2. Les cèl·lules es van subcultivar fins a una confluència del 80% utilitzant tripsina-EDTA al 0,05% (15400054, ThermoFisher Scientific), es van centrifugar a 300 g i es van sembrar a una densitat d'aproximadament 7 × 105 cèl·lules/ml. Tots els experiments es van dur a terme en cèl·lules SH-SY5Y indiferenciades entre els passatges 19 i 22. El PPA s'administra com a NaP. Dissoleu la pols de NaP (núm. CAS 137-40-6, fórmula química C3H5NaO2, P5436-100G, Sigma-Aldrich) en aigua tèbia MilliQ fins a una concentració d'1 M i guardeu-la a 4 °C. El dia del tractament, diluïu aquesta solució amb PPA 1 M fins a 3 mM i 5 mM de PPA en un medi sense sèrum (DMEM/F-12 amb L-glutamina). Les concentracions de tractament per a tots els experiments van ser sense PPA (0 mM, control), 3 mM i 5 mM de PPA. Els experiments es van dur a terme en almenys tres rèpliques biològiques.
Les cèl·lules SH-SY5Y es van sembrar en matràs de 25 cm5 a una velocitat de 5,5 × 105 cèl·lules/ml i es van fer créixer durant 24 hores. El tractament amb PPA es va afegir al matràs abans de les 24 h d'incubació. Recollir els pellets cel·lulars seguint els protocols normals de subcultiu de teixits mamífers (descrits anteriorment). Resuspendre el pellet cel·lular en 100 µl de glutaraldehid al 2,5%, 1× PBS i emmagatzemar-lo a 4 °C fins al seu processament. Les cèl·lules SH-SY5Y es van centrifugar breument per pelletar les cèl·lules i eliminar la solució de glutaraldehid al 2,5%, 1× PBS. Resuspendre el sediment en un gel d'agarosa al 4% preparat en aigua destil·lada (la proporció d'agarosa a volum de sediment és d'1:1). Els trossos d'agarosa es van col·locar en reixetes sobre plaques planes i es van recobrir amb 1-hexadecen abans de la congelació a alta pressió. Les mostres es van congelar en acetona seca al 100% a -90 °C durant 24 hores. A continuació, es va augmentar la temperatura a -80 °C i es va afegir una solució de tetròxid d'osmi a l'1% i glutaraldehid al 0,1%. Les mostres es van emmagatzemar a -80 °C durant 24 hores. Després d'això, la temperatura es va augmentar gradualment fins a la temperatura ambient durant diversos dies: de –80 °C a –50 °C durant 24 hores, a –30 °C durant 24 hores, a –10 °C durant 24 hores i finalment a temperatura ambient.
Després de la preparació criogènica, les mostres es van impregnar amb resina i es van fer seccions ultrafines (∼100 nm) utilitzant un ultramicrotom Leica Reichert UltracutS (Leica Microsystems). Les seccions es van tenyir amb un 2% d'acetat d'uranil i citrat de plom. Les mostres es van observar mitjançant un microscopi electrònic de transmissió FEI Tecnai 20 (ThermoFisher (anteriorment FEI), Eindhoven, Països Baixos) que funciona a 200 kV (transmissor Lab6) i una càmera CCD Gatan (Gatan, Regne Unit) equipada amb un filtre d'energia Tridiem.
En cada rèplica tècnica, es van adquirir almenys 24 imatges d'una sola cèl·lula, per a un total de 266 imatges. Totes les imatges es van analitzar mitjançant la macro Regió d'Interès (ROI) i la macro Mitocondri. La macro mitocondrial es basa en mètodes publicats17,31,32 i permet el processament per lots semiautomatitzat d'imatges TEM a Fiji/ImageJ69. En poques paraules: la imatge s'inverteix i s'inverteix mitjançant la subtracció de fons de bola rodant (radi de 60 píxels) i un filtre de passa-banda FFT (utilitzant límits superior i inferior de 60 i 8 píxels respectivament) i supressió de línies verticals amb una tolerància d'orientació del 5%. La imatge processada es llindaritza automàticament mitjançant un algorisme d'entropia màxima i es genera una màscara binària. Es van extreure les regions d'imatge associades amb ROI seleccionades manualment en imatges TEM en brut, caracteritzant els mitocondris i excloent la membrana plasmàtica i altres regions d'alt contrast. Per a cada ROI extreta, es van analitzar partícules binàries de més de 600 píxels i es van mesurar l'àrea de les partícules, el perímetre, els eixos major i menor, el diàmetre de Feret, la rodonesa i la circularitat mitjançant les funcions de mesura integrades de Fiji/ImageJ. Seguint Merrill, Flippo i Strack (2017), es van calcular l'àrea 2, la relació d'aspecte de les partícules (relació entre els eixos major i menor) i el factor de forma (FF) a partir d'aquestes dades, on FF = perímetre 2/4pi x àrea. La definició de la fórmula paramètrica es pot trobar a Merrill, Flippo i Strack (2017). Les macros esmentades estan disponibles a GitHub (vegeu la Declaració de disponibilitat de dades). De mitjana, es van analitzar aproximadament 5.600 partícules per tractament PPA, per a un total d'aproximadament 17.000 partícules (dades no mostrades).
Les cèl·lules SH-SH5Y es van col·locar en plaques de cultiu de 8 cambres (ThermoFisher, #155411) per permetre l'adhesió durant la nit i després es van incubar amb TMRE 1:1000 (ThermoFisher, #T669) i Hoechst 33342 1:200 (Sigma-Aldrich, H6024). Les imatges es van adquirir mitjançant làsers de 405 nm i 561 nm en un entorn de 10 minuts, i les imatges en brut es van adquirir com a piles z que contenien 10 micrografies d'imatge amb un pas az de 0,2 μm entre fotogrames d'imatge en 12 punts de temps posteriors. Les imatges es van recollir mitjançant una plataforma de superresolució Carl Zeiss LSM780 ELYRA PS.1 (Carl Zeiss, Oberkochen, Alemanya) utilitzant una lent LCI Plan Apochromate 100x/1.4 Oil DIC M27. Les imatges es van analitzar a ImageJ utilitzant un pipeline descrit anteriorment i el complement ImageJ per mesurar esdeveniments de fusió i fissió, nombre mitjà d'estructures mitocondrials i volum mitocondrial mitjà per cèl·lula33. Les macros MEL estan disponibles a GitHub (vegeu la Declaració de disponibilitat de dades).
Les cèl·lules SH-SY5Y es van cultivar en plaques de sis pous a una densitat de 0,3 × 106 cèl·lules/mL durant 24 hores abans del tractament. L'ARN es va extreure mitjançant el protocol Quick-RNA™ Miniprep (ZR R1055, Zymo Research) amb lleugeres modificacions: afegir 300 μl de tampó de lisi d'ARN a cada pou abans de retirar-lo i lisar cada mostra com a pas final amb 30 μl d'elució de DNasa/RNasa. aigua lliure. Es va comprovar la quantitat i la qualitat de totes les mostres mitjançant un espectrofotòmetre UV-Vis NanoDrop ND-1000. La proteïna total dels lisats cel·lulars es va obtenir mitjançant 200 μl de tampó de lisi RIPA i la concentració de proteïnes es va quantificar mitjançant l'assaig de proteïnes de Bradford70.
La síntesi de cDNA es va dur a terme utilitzant el kit de síntesi de cDNA Tetro™ (BIO-65043, Meridian Bioscience) segons les instruccions del fabricant amb algunes modificacions. El cDNA es va sintetitzar en reaccions de 20 μl utilitzant de 0,7 a 1 μg d'ARN total. Els encebadors es van seleccionar d'articles publicats anteriorment 42, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78 (Taula S1) i les sondes adjuntes es van dissenyar utilitzant l'eina PrimerQuest d'Integrated DNA Technologies. Tots els gens d'interès es van normalitzar al gen nuclear B2M. L'expressió gènica de STOML2, NRF1, NFE2L2, TFAM, cMYC i OPA1 es va mesurar mitjançant RT-qPCR. La mescla mestra incloïa LUNA Taq polimerasa (M3003L, New England Biolabs), 10 μM d'encebadors directes i inversos, cDNA i aigua de grau PCR per obtenir un volum final de 10 μL per a cada reacció. L'expressió dels gens de divisió i fissió (DRP1, MFN1/2) es va mesurar mitjançant assaigs multiplex TaqMan. La mescla mestra Luna Universal Probe qPCR (M3004S, New England Biolabs) es va utilitzar segons les instruccions del fabricant amb petites modificacions. La mescla mestra multiplex RT-qPCR inclou 1X LUNA Taq polimerasa, 10 μM d'encebadors directes i inversos, 10 μM de sonda, cDNA i aigua de grau PCR, donant com a resultat un volum final de 20 μL per a cada reacció. La RT-qPCR es va realitzar mitjançant Rotor-Gene Q 6-plex (QIAGEN RG - número de sèrie: R0618110). Les condicions de ciclatge es mostren a la Taula S1. Totes les mostres de cDNA es van amplificar per triplicat i es va generar una corba estàndard utilitzant una sèrie de dilucions de deu vegades. Els valors atípics en mostres per triplicat amb una desviació estàndard del llindar del cicle (Ct) > 0,5 es van eliminar de l'anàlisi per garantir la reproductibilitat de les dades30,72. L'expressió gènica relativa es va calcular mitjançant el mètode 2-ΔΔCt79.
Es van barrejar mostres de proteïnes (60 μg) amb tampó de càrrega de Laemmli en una proporció de 2:1 i es van executar en un gel de proteïnes incolor al 12% (Bio-Rad #1610184). Les proteïnes es van transferir a una membrana de PVDF (fluorur de polivinilidè) (#170-84156, Bio-Rad) utilitzant el sistema Trans-Blot Turbo (#170-4155, Bio-Rad). La membrana es va bloquejar i es va incubar amb els anticossos primaris adequats (OPA1, MFN1, MFN2 i DRP1) (diluïts 1:1000) durant 48 hores, seguit d'una incubació amb anticossos secundaris (1:10.000) durant 1 hora. A continuació, es van obtenir imatges de les membranes utilitzant el substrat Clarity Western ECL (#170-5061, Bio-Rad) i es van registrar mitjançant un sistema Bio-Rad ChemiDoc MP. Es va utilitzar ImageLab versió 6.1 per a l'anàlisi de Western blot. El gel i la transferència originals es mostren a la figura S1. La informació sobre els anticossos es proporciona a la taula S2.
Els conjunts de dades es presenten com la mitjana i l'error estàndard de la mitjana (SEM) d'almenys tres mostres independents. Els conjunts de dades es van comprovar per a la normalitat mitjançant la prova de Shapiro-Wilks (tret que s'indiqui el contrari) abans d'assumir una distribució gaussiana i desviacions estàndard iguals i procedir amb les anàlisis. A més, es va analitzar el conjunt de dades mitjançant la prova MEL LSD de Fisher (p < 0,05), l'ANOVA unidireccional (mitjana del tractament vs. control) i la prova de comparació múltiple de Dunnett per determinar la significació (p < 0,05). Els valors p significatius es mostren al gràfic com a *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Totes les anàlisis estadístiques i els gràfics es van realitzar i generar mitjançant GraphPad Prism 9.4.0.
Les macros Fiji/ImageJ per a l'anàlisi d'imatges TEM estan disponibles públicament a GitHub: https://github.com/caaja/TEMMitoMacro. La macro Mitochondrial Event Locator (MEL) està disponible públicament a GitHub: https://github.com/rensutheart/MEL-Fiji-Plugin.
Meiliana A., Devi NM i Vijaya A. Mitocondris: reguladors mestres del metabolisme, l'homeòstasi, l'estrès, l'envelliment i l'epigenètica. Indonesian. Biomedical Science. J. 13, 221–241 (2021).
Ben-Shachar, D. Disfunció mitocondrial multifacètica en l'esquizofrènia, el complex I com a possible objectiu patològic. Esquizofrènia. recurs. 187, 3–10 (2017).
Bose, A. i Beal, MF Disfunció mitocondrial en la malaltia de Parkinson. J. Neurochemistry. 139, 216–231 (2016).
Sharma VK, Singh TG i Mehta V. Mitocondris estressats: objectius d'invasió en la malaltia d'Alzheimer. Mitochondria 59, 48–57 (2021).
Belenguer P., Duarte JMN, Shook PF i Ferreira GK. Mitocondris i cervell: bioenergètica i més. Neurotoxines. Resource. 36, 219–238 (2019).
Rangaraju, V. et al. Mitocondris pleiotròpics: l'impacte dels mitocondris en el desenvolupament neuronal i la malaltia. J. Neuroscience. 39, 8200–8208 (2019).
Cardaño-Ramos, C. i Morais, VA Biogènesi mitocondrial en neurones: com i on. Internacionalitat. J. Mohr. La ciència. 22, 13059 (2021).
Yu, R., Lendahl, U., Nister, M. i Zhao, J. Regulació de la dinàmica mitocondrial dels mamífers: oportunitats i reptes. front. endocrine. (Lausanne) 11, 374 (2020).
Khacho, M. i Slack, RS Dinàmica mitocondrial en la regulació de la neurogènesi: des del cervell en desenvolupament fins al cervell adult. Development. Dynamic. 247, 47–53 (2018).