Actual *Adreça actual: Colònia 50931, Alemanya, Clúster d'Excel·lència de Colònia per a la Recerca sobre la Resposta a l'Estrès Cel·lular en Malalties Relacionades amb l'Envelliment (CECAD).
La neurodegeneració de les malalties mitocondrials es considera irreversible perquè la plasticitat metabòlica de les neurones és limitada, però l'efecte de la disfunció mitocondrial sobre l'autonomia cel·lular del metabolisme neuronal al cos és poc conegut. Aquí, introduïm el proteoma específic de cèl·lules de neurones de Purkinje amb deficiència progressiva d'OXPHOS causada per una dinàmica de fusió mitocondrial interrompuda. Vam descobrir que la disfunció mitocondrial va desencadenar un canvi profund en el camp de la proteòmica, que finalment va conduir a l'activació seqüencial de programes metabòlics precisos abans de la mort cel·lular. Inesperadament, vam determinar la inducció òbvia de la piruvat carboxilasa (PCx) i altres enzims antienvelliment que complementen els intermediaris del cicle TCA. La inhibició de la PCx va exacerbar l'estrès oxidatiu i la neurodegeneració, cosa que indica que l'aterosclerosi té un efecte protector en les neurones que manquen d'OXPHOS. La restauració de la fusió mitocondrial en neurones terminalment degenerades inverteix completament aquestes característiques metabòliques, evitant així la mort cel·lular. Els nostres resultats identifiquen vies prèviament desconegudes que confereixen resiliència a la disfunció mitocondrial i mostren que la neurodegeneració es pot revertir fins i tot en les etapes avançades de la malaltia.
El paper central dels mitocondris en el manteniment del metabolisme energètic neuronal es veu emfatitzat pels extensos símptomes neurològics associats a les malalties mitocondrials humanes. La majoria d'aquestes malalties són causades per mutacions genètiques que regulen l'expressió gènica mitocondrial (1, 2) o la destrucció de gens relacionada amb la dinàmica mitocondrial, que afecten indirectament l'estabilitat de l'ADN mitocondrial (ADNmt) (3, 4). El treball en models animals ha demostrat que, en resposta a la disfunció mitocondrial en els teixits circumdants, es poden activar vies metabòliques conservadores (5-7), cosa que proporciona informació important per a una comprensió profunda de la patogènesi d'aquestes malalties complexes. En contrast, la nostra comprensió dels canvis metabòlics de tipus cel·lulars específics causats pel fracàs general de la producció d'adenosina trifosfat (ATP) mitocondrial cerebral és fonamental (8), cosa que emfatitza la necessitat d'identificar dianes terapèutiques que es puguin utilitzar per prevenir o prevenir malalties. Prevenir la neurodegeneració (9). La manca d'informació es deu al fet que es considera àmpliament que les cèl·lules nervioses tenen una flexibilitat metabòlica molt limitada en comparació amb els tipus cel·lulars dels teixits circumdants (10). Atès que aquestes cèl·lules tenen un paper central en la coordinació del subministrament de metabòlits a les neurones per promoure la transmissió sinàptica i respondre a lesions i malalties, la capacitat d'adaptar el metabolisme cel·lular a les condicions desafiadores del teixit cerebral està gairebé limitada a les cèl·lules glials (11-14). A més, l'heterogeneïtat cel·lular inherent del teixit cerebral dificulta en gran mesura l'estudi dels canvis metabòlics que es produeixen en subgrups neuronals específics. Com a resultat, se sap poc sobre les conseqüències cel·lulars i metabòliques exactes de la disfunció mitocondrial en les neurones.
Per tal d'entendre les conseqüències metabòliques de la disfunció mitocondrial, vam aïllar neurones de Purkinje (PN) en diferents estadis de neurodegeneració causada per la destrucció de la fusió de la membrana externa mitocondrial (Mfn2). Tot i que les mutacions de Mfn2 en humans estan associades amb una forma de neuropatia sensorial motora hereditària coneguda com a Charcot-Marie-Tooth tipus 2A (15), la destrucció condicional de Mfn2 en ratolins és un mètode ben reconegut d'inducció de la disfunció de fosforilació oxidativa (OXPHOS). Els diversos subtipus neuronals (16-19) i el fenotip neurodegeneratiu resultant s'acompanyen de símptomes neurològics progressius, com ara trastorns del moviment (18, 19) o atàxia cerebel·losa (16). Mitjançant una combinació de proteòmica quantitativa sense marcatge (LFQ), metabolòmica, imatges i mètodes virològics, mostrem que la neurodegeneració progressiva indueix fortament la piruvat carboxilasa (PCx) i altres factors implicats en l'arteriosclerosi de les PN in vivo. L'expressió d'enzims. Per verificar la rellevància d'aquesta troballa, vam reduir específicament l'expressió de PCx en PN amb deficiència de Mfn2, i vam descobrir que aquesta operació agreujava l'estrès oxidatiu i accelerava la neurodegeneració, demostrant així que l'azoospèrmia confereix mort cel·lular. Adaptabilitat metabòlica. L'expressió severa de MFN2 pot rescatar completament la PN de degeneració terminal amb deficiència severa d'OXPHOS, consum massiu d'ADN mitocondrial i xarxa mitocondrial aparentment trencada, la qual cosa emfatitza encara més que aquesta forma de neurodegeneració es pot recuperar fins i tot en l'etapa avançada de la malaltia abans de la mort cel·lular.
Per tal de visualitzar els mitocondris en les PN amb Mfn2 knockout, vam utilitzar una soca de ratolí que permet als mitocondris dependents de Cre dirigir-se a l'expressió de la proteïna fluorescent groga (YFP) (mtYFP) (20) i vam comprovar la morfologia mitocondrial in vivo. Vam descobrir que la destrucció del gen Mfn2 en les PN conduiria a la divisió gradual de la xarxa mitocondrial (Figura S1A), i el canvi més primerenc es va trobar a les 3 setmanes d'edat. En canvi, la degeneració substancial de la capa de cèl·lules PN, com ho demostra la pèrdua de la immunotinció de calbindina, no va començar fins a les 12 setmanes d'edat (Figura 1, A i B). La discrepància temporal entre els primers canvis en la morfologia mitocondrial i l'aparició visible de la mort neuronal ens va impulsar a investigar els canvis metabòlics desencadenats per la disfunció mitocondrial abans de la mort cel·lular. Vam desenvolupar una estratègia basada en la classificació de cèl·lules activades per fluorescència (FACS) per aïllar PN que expressen YFP (YFP+) (Figura 1C), i en ratolins de control (Mfn2+ / loxP :: mtYFP loxP- stop-loxP: : L7-cre), d'ara endavant denominades CTRL (Figura S1B). L'optimització de l'estratègia de comporta basada en la intensitat relativa del senyal YFP ens permet purificar el cos YFP+ (YFPhigh) de PN de no PN (YFPneg) (Figura S1B) o putatius fragments fluorescents d'axons/dendrítics (YFPlow; Figura S1D, esquerra), confirmat per microscopi confocal (Figura S1D, dreta). Per tal de verificar la identitat de la població classificada, vam dur a terme proteòmica LFQ i després anàlisi de components principals, i vam trobar que hi ha una separació clara entre les cèl·lules YFPhigh i YFPneg (Figura S1C). Les cèl·lules YFPhigh van mostrar un enriquiment net de marcadors de PN coneguts (és a dir, Calb1, Pcp2, Grid2 i Itpr3) (21, 22), però cap enriquiment de proteïnes expressades habitualment en neurones o altres tipus de cèl·lules (Figura 1D). Una comparació entre mostres de cèl·lules YFPhigh classificades recollides en experiments independents va mostrar un coeficient de correlació > 0,9, cosa que demostra una bona reproductibilitat entre rèpliques biològiques (Figura S1E). En resum, aquestes dades van validar el nostre pla per a l'aïllament agut i específic de PN factible. Com que el sistema controlador L7-cre utilitzat indueix la recombinació en mosaic durant la primera setmana després del part (23), vam començar a sacrificar ratolins de les neurones recollides mitjançant CTRL i condicionals (Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP :: L7-cre). Un cop completada la recombinació, s'anomena Mfn2cKO a les 4 setmanes d'edat. Com a punt final, vam triar les 8 setmanes d'edat quan la capa de PN estava intacta malgrat l'evident fragmentació mitocondrial (Figura 1B i Figura S1A). En total, vam quantificar un total de 3013 proteïnes, de les quals aproximadament el 22% es basaven en anotacions de MitoCarta 2.0 basades en el proteoma mitocondrial com a mitocondri (Figura 1E) (Figura 1E) (24). L'anàlisi d'expressió gènica diferencial realitzada a la setmana 8 va mostrar que només el 10,5% de totes les proteïnes tenien canvis significatius (Figura 1F i Figura S1F), de les quals 195 proteïnes estaven regulades a la baixa i 120 proteïnes estaven regulades a l'alça (Figura 1F). Cal destacar que "l'anàlisi de vies innovadores" d'aquest conjunt de dades mostra que els gens expressats diferencialment pertanyen principalment a un conjunt restringit de vies metabòliques específiques (Figura 1G). Curiosament, tot i que la regulació a la baixa de les vies relacionades amb OXPHOS i la senyalització del calci confirma la inducció de disfunció mitocondrial en PN amb deficiència de fusió, altres categories que impliquen principalment el metabolisme dels aminoàcids estan significativament regulades a l'alça, la qual cosa està en línia amb el metabolisme que es produeix en les PN mitocondrials. El recablejat és consistent.
(A) Fotografies confocals representatives de seccions cerebel·loses de ratolins CTRL i Mfn2cKO que mostren una pèrdua progressiva de PN (calbindina, gris); els nuclis es van contratenyir amb DAPI. (B) Quantificació de (A) (anàlisi de la variància unidireccional, ***P<0,001; n = 4 a 6 cercles de tres ratolins). (C) Flux de treball experimental. (D) Distribució del mapa de calor de marcadors específics de Purkinje (a dalt) i altres tipus de cèl·lules (al mig). (E) Diagrama de Venn que mostra el nombre de proteïnes mitocondrials identificades a la PN classificada. (F) Gràfic del volcà de proteïnes expressades diferencialment en neurones Mfn2cKO a les 8 setmanes (valor de tall de significació d'1,3). (G) L'anàlisi de la via de la creativitat mostra les cinc vies de regulació a l'alça (vermell) i de regulació a la baixa (blau) més importants a la PN Mfn2cKO classificada com a 8 setmanes. Es mostra el nivell mitjà d'expressió de cada proteïna detectada. Mapa de calor en escala de grisos: valor P ajustat. ns, no important.
Les dades proteòmiques van mostrar que l'expressió proteica dels complexos I, III i IV va disminuir gradualment. Els complexos I, III i IV contenien tots subunitats essencials codificades per mtDNA, mentre que el complex II, que només estava codificat nuclearment, no es va veure bàsicament afectat (Figura 2A i Figura S2A). D'acord amb els resultats proteòmics, la immunohistoquímica de seccions de teixit cerebel·lós va mostrar que el nivell de la subunitat MTCO1 (subunitat 1 de la citocrom C oxidasa mitocondrial) del complex IV en PN va disminuir gradualment (Figura 2B). La subunitat Mtatp8 codificada per mtDNA es va reduir significativament (Figura S2A), mentre que el nivell en estat estacionari de la subunitat d'ATP sintasa codificada nuclearment es va mantenir sense canvis, la qual cosa és coherent amb el conegut complex F1 del subconjunt d'ATP sintasa estable quan l'expressió de mtDNA és estable. La formació és consistent. Interrupció (7). L'avaluació del nivell de mtDNA en les PN Mfn2cKO classificades mitjançant la reacció en cadena de la polimerasa en temps real (qPCR) va confirmar la disminució gradual del nombre de còpies de mtDNA. En comparació amb el grup de control, a les 8 setmanes d'edat, només es va retenir aproximadament el 20% del nivell de mtDNA (Figura 2C). D'acord amb aquests resultats, es va utilitzar la tinció de microscòpia confocal de les PN Mfn2cKO per detectar ADN, mostrant el consum de nucleòtids mitocondrials dependent del temps (Figura 2D). Vam trobar que només alguns candidats implicats en la degradació de proteïnes mitocondrials i la resposta a l'estrès estaven regulats a l'alça, incloent Lonp1, Afg3l2 i Clpx, i els factors d'assemblatge complex OXPHOS. No es van detectar canvis significatius en els nivells de proteïnes implicades en l'apoptosi (Figura S2B). De la mateixa manera, vam trobar que els canals mitocondrials i del reticle endoplasmàtic implicats en el transport de calci només presenten canvis menors (Figura S2C). A més, l'avaluació de les proteïnes relacionades amb l'autofàgia no va trobar canvis significatius, la qual cosa és coherent amb la inducció visible d'autofagosomes observada in vivo mitjançant immunohistoquímica i microscòpia electrònica (Figura S3). Tanmateix, la disfunció progressiva d'OXPHOS en les PN s'acompanya de canvis mitocondrials ultraestructurals evidents. Es poden observar grups mitocondrials en els cossos cel·lulars i els arbres dendrítics de les PN Mfn2cKO de 5 i 8 setmanes, i l'estructura de la membrana interna ha experimentat canvis profunds (Figura S4, A i B). D'acord amb aquests canvis ultraestructurals i una disminució significativa del mtDNA, l'anàlisi de talls cerebel·losos cerebrals aguts amb èster metílic de tetrametilrodamina (TMRM) va mostrar que el potencial de membrana mitocondrial en les PN Mfn2cKO havia disminuït significativament (Figura S4C).
(A) Anàlisi del curs temporal del nivell d'expressió del complex OXPHOS. Només es consideren les proteïnes amb P<0,05 a les 8 setmanes (ANOVA bidireccional). Línia puntejada: Sense ajust en comparació amb CTRL. (B) Esquerra: Un exemple d'una secció cerebel·losa marcada amb un anticòs anti-MTCO1 (barra d'escala, 20 μm). L'àrea ocupada pels cossos cel·lulars de Purkinje està coberta de groc. Dreta: Quantificació dels nivells de MTCO1 (anàlisi de la variància unidireccional; n = 7 a 20 cèl·lules analitzades de tres ratolins). (C) Anàlisi qPCR del nombre de còpies de mtDNA a la PN ordenada (anàlisi de la variància unidireccional; n = 3 a 7 ratolins). (D) Esquerra: Un exemple d'una llesca cerebel·losa marcada amb un anticòs anti-ADN (barra d'escala, 20 μm). L'àrea ocupada pels cossos cel·lulars de Purkinje està coberta de groc. Dreta: Quantificació de lesions de mtDNA (anàlisi de la variància unidireccional; n = 5 a 9 cèl·lules de tres ratolins). (E) Un exemple d'una secció cerebel·losa aguda que mostra cèl·lules mitoYFP + Purkinje (fletxa) en un enregistrament de patch clamp de cèl·lules senceres. (F) Quantificació de la corba IV. (G) Enregistraments representatius de la injecció de corrent despolaritzant en cèl·lules de Purkinje CTRL i Mfn2cKO. Traça superior: el primer pols que va desencadenar la PA. Traça inferior: freqüència màxima de PA. (H) Quantificació d'entrades espontànies postsinàptiques (sPSP). La traça d'enregistrament representativa i la seva relació de zoom es mostren a (I). Anàlisi unidireccional de la variància analitzada de n = 5 a 20 cèl·lules de tres ratolins. Les dades s'expressen com a mitjana ± SEM; *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001. (J) Traces representatives de PA espontània enregistrades mitjançant el mode de patch clamp perforat. Traça superior: freqüència màxima de PA. Traça inferior: zoom d'una sola PA. (K) Quantificar la freqüència mitjana i màxima de PA segons (J). Prova de Mann-Whitney; n = 5 cèl·lules es van analitzar de quatre ratolins. Les dades s'expressen com a mitjana ± SEM; no són importants.
Es va detectar un dany evident a l'OXPHOS en la neurona neuronal Mfn2cKO de 8 setmanes d'edat, cosa que indica que la funció fisiològica de les neurones és greument anormal. Per tant, vam analitzar les característiques elèctriques passives de les neurones amb deficiència d'OXPHOS a les 4 a 5 setmanes i a les 7 a 8 setmanes mitjançant enregistraments de patch clamp de cèl·lules senceres en talls cerebel·losos aguts (Figura 2E). Inesperadament, el potencial de membrana en repòs mitjà i la resistència d'entrada de les neurones Mfn2cKO van ser similars al control, tot i que hi va haver diferències subtils entre les cèl·lules (Taula 1). De la mateixa manera, a les 4 a 5 setmanes d'edat, no es van trobar canvis significatius en la relació corrent-voltatge (corba IV) (Figura 2F). Tanmateix, cap neurona Mfn2cKO de 7 a 8 setmanes va sobreviure al règim IV (pas d'hiperpolarització), cosa que indica que hi ha una clara sensibilitat al potencial d'hiperpolarització en aquesta etapa tardana. En canvi, en les neurones Mfn2cKO, els corrents despolaritzants que causen descàrregues de potencial d'acció repetitiva (PA) són ben tolerats, cosa que indica que els seus patrons de descàrrega generals no són significativament diferents dels de les neurones de control de 8 setmanes (Taula 1 i Figura 2G). De la mateixa manera, la freqüència i l'amplitud dels corrents postsinàptics espontanis (sPSC) van ser comparables a les del grup de control, i la freqüència d'esdeveniments va augmentar de 4 setmanes a 5 setmanes a 7 setmanes a 8 setmanes amb un augment similar (Figura 2, H i I). El període de maduració sinàptica en PN (25). Es van obtenir resultats similars després de pegats de PN perforats. Aquesta configuració impedeix la possible compensació dels defectes cel·lulars d'ATP, com podria passar en el registre de pegats de cèl·lules senceres. En particular, el potencial de membrana en repòs i la freqüència de tret espontani de les neurones Mfn2cKO no es van veure afectats (Figura 2, J i K). En resum, aquests resultats indiquen que les PN amb una disfunció OXPHOS òbvia poden fer front bé als patrons de descàrrega d'alta freqüència, cosa que indica que hi ha un mecanisme de compensació que els permet mantenir respostes electrofisiològiques gairebé normals.
Les dades s'expressen com a mitjana ± SEM (anàlisi de la variància unidireccional, prova de comparació múltiple de Holm-Sidak; *P < 0,05). El número d'unitat s'indica entre parèntesis.
Ens vam proposar investigar si alguna categoria del conjunt de dades proteòmiques (Figura 1G) inclou vies que poden contrarestar la deficiència greu d'OXPHOS, cosa que explica per què la PN afectada pot mantenir una electrofisiologia gairebé normal (Figura 2, E a K). L'anàlisi proteòmica va mostrar que els enzims implicats en el catabolisme dels aminoàcids de cadena ramificada (BCAA) estaven significativament regulats a l'alça (Figura 3A i Figura S5A), i el producte final acetil-CoA (CoA) o succinil CoA pot suplementar els tricarboxilats en el cicle de l'àcid arterioscleròtic (TCA). Vam trobar que el contingut de la transaminasa BCAA 1 (BCAT1) i BCAT2 va augmentar. Catalitzen el primer pas del catabolisme dels BCAA generant glutamat a partir de l'α-cetoglutarat (26). Totes les subunitats que formen el complex cetoàcid deshidrogenasa de cadena ramificada (BCKD) estan regulades a l'alça (el complex catalitza la descarboxilació posterior i irreversible de l'esquelet de carboni BCAA resultant) (Figura 3A i Figura S5A). Tanmateix, no es van trobar canvis evidents en els BCAA en si mateixos a les PN classificades, cosa que pot ser deguda a l'augment de l'absorció cel·lular d'aquests aminoàcids essencials o a l'ús d'altres fonts (glucosa o àcid làctic) per complementar el cicle TCA (Figura S5B). Les PN que no tenen OXPHOS també van mostrar un augment de les activitats de descomposició i transaminació de la glutamina a les 8 setmanes d'edat, cosa que es pot reflectir en la regulació a l'alça dels enzims mitocondrials glutaminasa (GLS) i glutamina piruvat transaminasa 2 (GPT2) (Figura 3, A i C). Val a dir que la regulació a l'alça de GLS es limita a la isoforma empalmada de la glutaminasa C (GLS-GAC) (el canvi de Mfn2cKO/CTRL és aproximadament 4,5 vegades, P = 0,05), i la seva regulació a l'alça específica en els teixits cancerosos pot donar suport a la bioenergia mitocondrial. (27).
(A) El mapa de calor mostra el canvi de plegament en el nivell de proteïna per a la via especificada a les 8 setmanes. (B) Exemple d'un tall cerebel·lós marcat amb anticòs anti-PCx (barra d'escala, 20 μm). La fletxa groga apunta al cos cel·lular de Purkinje. (C) Anàlisi de l'expressió de proteïnes al llarg del temps identificada com a candidata important per a l'aterosclerosi (prova t múltiple, *FDR <5%; n = 3-5 ratolins). (D) A dalt: Un diagrama esquemàtic que mostra les diferents maneres d'entrar al carboni marcat contingut en el traçador [1-13C]piruvat (és a dir, via PDH o via transarterial). A baix: El gràfic de violí mostra el percentatge de carboni marcat individualment (M1) convertit en àcid aspàrtic, àcid cítric i àcid màlic després de marcar talls cerebel·losos aguts amb [1-13C]piruvat (prova t aparellada; ** P <0,01). (E) Anàlisi completa de la història temporal de la via indicada. Només cal tenir en compte les proteïnes amb P <0,05 a les 8 setmanes. Línia discontínua: sense valor d'ajust (anàlisi de la variància bidireccional; * P <0,05; *** P <0,001). Les dades s'expressen com a mitjana ± SEM.
En la nostra anàlisi, el catabolisme dels BCAA s'ha convertit en una de les vies clau de regulació a l'alça. Aquest fet suggereix fermament que el volum de ventilació que entra al cicle TCA pot canviar en les PN amb deficiència d'OXPHOS. Això pot representar una forma important de recablejat metabòlic neuronal, que pot tenir un impacte directe en la fisiologia neuronal i la supervivència durant el manteniment de la disfunció OXPHOS greu. D'acord amb aquesta hipòtesi, vam trobar que el principal enzim antiateroscleròtic PCx està regulat a l'alça (Mfn2cKO/CTRL canvia aproximadament 1,5 vegades; Figura 3A), cosa que catalitza la conversió de piruvat a oxaloacetat (28), que es creu que es troba al teixit cerebral. L'expressió en està restringida als astròcits (29, 30). D'acord amb els resultats proteòmics, la microscòpia confocal va mostrar que l'expressió de PCx augmentava específicament i significativament en les PN amb deficiència d'OXPHOS, mentre que la reactivitat de PCx es restringia principalment a les cèl·lules glials de Bergmann adjacents del control (Figura 3B). Per provar funcionalment la sobreexpressió observada de PCx, vam tractar talls cerebel·losos aguts amb el traçador [1-13C]piruvat. Quan el piruvat s'oxidava per la piruvat deshidrogenasa (PDH), el seu marcador isotòpic desapareixia, però s'incorporava als intermediaris del cicle TCA quan el piruvat es metabolitza mitjançant reaccions vasculars (Figura 3D). En suport de les nostres dades proteòmiques, vam observar un gran nombre de marcadors d'aquest traçador a l'àcid aspàrtic dels talls de Mfn2cKO, mentre que l'àcid cítric i l'àcid màlic també van tenir una tendència moderada, tot i que no significativa (Figura 3D).
En les neurones de dopamina de ratolins MitoPark amb disfunció mitocondrial causada per neurones de dopamina que destrueixen específicament el gen del factor de transcripció mitocondrial A (Tfam) (Figura S6B), l'expressió de PCx també es va regular a l'alça significativament (31), cosa que indica que l'arteriosclerosi de l'àcid acetànic. L'aparició de la malaltia està regulada durant la disfunció de l'OXPHOS neuronal al cos. Cal destacar que s'ha descobert que els enzims únics (32-34) que es poden expressar en neurones que poden estar associades amb l'arteriosclerosi estan significativament regulats a l'alça en les PN que manquen d'OXPHOS, com ara la propionil-CoA carboxilasa (PCC-A), el malonil-CoA converteix el propionil-CoA en succinil-CoA i l'enzim màlic mitocondrial 3 (ME3), la funció principal del qual és recuperar el piruvat del malat (Figura 3, A i C) (33, 35). A més, vam trobar un augment significatiu en l'enzim Pdk3, que fosforila i per tant inactiva la PDH (36), mentre que no es van detectar canvis en l'enzim Pdp1 que activa la PDH ni en el propi complex enzimàtic PDH (Figura 3A). De manera consistent, en les PN Mern2cKO, la fosforilació de la subunitat α1 α (PDHE1α) del component E1 de la piruvat deshidrogenasa del complex PDH en Ser293 (que se sap que inhibeix l'activitat enzimàtica de la PDH) es va veure millorada (Figura S6C) (Figura S6C). El piruvat no té accés vascular.
Finalment, vam descobrir que la supervia de la biosíntesi de serina i glicina, el cicle relacionat del folat mitocondrial (1C) i la biosíntesi de prolina (Figura 1G i Figura S5C) estan significativament regulades a l'alça, segons els informes, durant el procés d'activació. Els teixits circumdants s'activen amb disfunció mitocondrial (5-7). L'anàlisi confocal que donava suport a aquestes dades proteòmiques va mostrar que en la NP amb OXPHOS absent, les llesques cerebel·loses de ratolins de 8 setmanes van ser sotmeses a serina hidroximetiltransferasa 2 (SHMT2), un enzim clau del cicle del folat mitocondrial. Resposta immunitària significativa (Figura S5D). En 13 llesques cerebel·loses agudes incubades amb CU-glucosa, els experiments de traçat metabòlic van confirmar encara més la regulació a l'alça de la biosíntesi de serina i prolina, cosa que indica que el flux d'isoformes de carboni a la serina i la prolina va augmentar (Figura S5E). Com que les reaccions promogudes per GLS i GPT2 són responsables de la síntesi de glutamat a partir de glutamina i la transaminació entre glutamat i α-cetoglutarat, la seva regulació a l'alça indica que les neurones amb deficiència d'OXPHOS tenen una major demanda de glutamat, cosa que pot tenir com a objectiu mantenir l'augment de la biosíntesi de prolina (Figura S5C). En contrast amb aquests canvis, una anàlisi proteòmica dels astròcits cerebel·losos de ratolins Mfn2cKO específics de PN va mostrar que aquestes vies (incloses totes les antiperoxidases) no van canviar significativament en l'expressió, demostrant així que aquesta redirecció metabòlica és selectiva a la PN degradada (Fig. S6, D a G).
En resum, aquestes anàlisis van revelar patrons significativament diferents d'activació temporal de vies metabòliques específiques en les PN. Tot i que una funció mitocondrial neuronal anormal pot conduir a l'aterosclerosi primerenca i a la remodelació 1C (Figura 3E i Figura S5C), i fins i tot a canvis predictibles en l'expressió dels complexos I i IV, els canvis en la síntesi de novo de serina només són evidents en les etapes avançades. Disfunció OXPHOS (Figura 3E i Figura S5C). Aquestes troballes defineixen un procés seqüencial en què la resposta mitocondrial (cicle 1C) i citoplasmàtica (biosíntesi de serina) induïda per l'estrès responen sinèrgicament amb l'augment de l'aterosclerosi en el cicle TCA per remodelar el metabolisme neuronal.
Les PN deficients en OXPHOS de 8 setmanes poden mantenir l'activitat d'excitació d'alta freqüència i experimentar una reconnexió metabòlica significativa per compensar la disfunció mitocondrial. Aquest descobriment planteja una possibilitat interessant que, fins i tot en aquest moment, aquestes cèl·lules també poden rebre intervenció terapèutica per retardar o prevenir la neurodegeneració tardana. Vam resoldre aquesta possibilitat mitjançant dues intervencions independents. En el primer mètode, vam dissenyar un vector de virus adenoassociat (AAV) dependent de Cre perquè MFN2 es pugui expressar selectivament en PN deficients en OXPHOS in vivo (Figura S7A). L'AAV que codifica MFN2 i el gen reporter fluorescent mCherry (Mfn2-AAV) es van verificar en cultius neuronals primaris in vitro, cosa que va fer que MFN2 s'expressés de manera dependent de Cre i va rescatar la morfologia mitocondrial, evitant així la neuromutació en neurones Mfn2cKO (Figura S7, B, D i E). A continuació, vam dur a terme experiments in vivo per administrar estereotàcticament Mfn2-AAV de 8 setmanes d'edat a l'escorça cerebel·losa de ratolins Mfn2cKO i de control, i vam analitzar ratolins de 12 setmanes d'edat (Figura 4A). Els ratolins Mfn2cKO tractats van morir (Figura 1, A i B) (16). La transducció viral in vivo va resultar en una expressió selectiva de PN en alguns cercles cerebel·losos (Figura S7, G i H). La injecció de l'AAV de control que expressava només mCherry (Ctrl-AAV) no va tenir cap efecte significatiu sobre el grau de neurodegeneració en animals Mfn2cKO. En canvi, l'anàlisi de Mfn2cKO transduïts amb Mfn2-AAV va mostrar un efecte protector significatiu de la capa de cèl·lules PN (Figura 4, B i C). En particular, la densitat neuronal sembla ser gairebé indistingible de la dels animals de control (Figura 4, B i C, i Figura S7, H i I). L'expressió de MFN1 però no de MFN2 és igualment eficaç per salvar la mort neuronal (Figura 4C i Figura S7, C i F), la qual cosa indica que l'expressió de MFN1 ectòpic pot complementar eficaçment la manca de MFN2. Una anàlisi posterior a nivell de neurona únic va mostrar que Mfn2-AAV va rescatar en gran mesura l'ultraestructura dels mitocondris, va normalitzar els nivells de mtDNA i va revertir l'alta expressió del marcador antiangiogènesi PCx ​​(Figura 4, C a E). La inspecció visual dels ratolins Mfn2cKO rescatats en estat de repòs va mostrar que la seva postura i els símptomes motors (moviment S1 a S3) van millorar. En conclusió, aquests experiments mostren que la reintroducció retardada de MFN2 en neurones neuronals amb deficiència greu d'OXPHOS és suficient per revertir el consum de mtDNA i induir l'aterosclerosi, prevenint així la degeneració dels axons i la mort neuronal in vivo.
(A) Un esquema que mostra el calendari experimental per a la injecció d'AAV que codifica MFN2 quan s'activa la via metabòlica indicada. (B) Imatges confocals representatives de talls cerebel·losos de 12 setmanes transduïts a les 8 setmanes en ratolins Mfn2cKO i marcats amb anticòs anti-Calbindina. Dreta: Escalat de fibres axòniques. L'escala del zoom de l'axó és de 450 i 75 μm. (C) Esquerra: Quantificació de la densitat de cèl·lules de Purkinje en el bucle de transducció d'AAV (AAV+) (anàlisi de la variància unidireccional; n = 3 ratolins). Dreta: anàlisi de l'enfocament de l'ADNmt en PN transduïda a la setmana 12 (prova t no aparellada; n = 6 cèl·lules de tres ratolins). * P <0,05; ** P <0,01. (D) Micrografies electròniques de transmissió representatives de PN de seccions cerebel·losos de Mfn2cKO transduïdes amb els vectors virals indicats. La màscara rosa il·lustra l'àrea ocupada per les dendrites i el quadrat groc puntejat il·lustra el zoom que es proporciona a la dreta; n representa el nucli. Barra d'escala, 1 μm. (E) mostra un exemple de tinció de PCx en PN transduïda a les 12 setmanes. Barra d'escala, 20 μm. OE, sobreexpressió; FC, canvi de plec.
Finalment, vam investigar la importància de la supervivència cel·lular induïda per peroxidasa en PN que han experimentat disfunció OXPHOS. Vam generar mCherry que codifica AAV-shRNA (ARN de forquilla curta) dirigit específicament a l'ARNm de PCx de ratolí (AAV-shPCx), i vam injectar el virus o el seu control codificat (AAV-scr) al cerebel de ratolins Mfn2cKO. La injecció es va realitzar a la quarta setmana d'edat (Figura 5A) per aconseguir una inhibició efectiva de PCx durant el període en què l'expressió de PCx augmentava (Figura 3C) i la capa de cèl·lules PN encara estava intacta (Figura 1A). Val la pena assenyalar que la inhibició de PCx (Figura S8A) condueix a una acceleració significativa de la mort de PN, que es limita a l'anell infectat (Figura 5, B i C). Per tal d'entendre el mecanisme dels efectes metabòlics induïts per la regulació a l'alça de PCx, vam estudiar l'estat redox de les PN després de la inactivació de PCx i l'expressió simultània del biosensor òptic Grx1-roGFP2 mediat per AAV (Figura S8, B a D) per avaluar el canvi relatiu del potencial redox del pèptid amb glutatió (38). A continuació, vam realitzar microscòpia d'imatges de fluorescència de dos fotons de per vida (FLIM) en talls de cervell aguts de Mfn2cKO de 7 setmanes d'edat o companys de ventrada de control per detectar possibles canvis en l'estat redox citoplasmàtic després de verificar les condicions FLIM (Figura S8, E a G). L'anàlisi va mostrar un augment significatiu en l'estat d'oxidació d'una sola PN de Mfn2cKO que no té expressió de PCx, cosa que és diferent de les neurones de control o les PN de Mfn2cKO que només expressen shRNA codificat (Figura 5, D i E). Quan l'expressió de PCx es va regular a la baixa, el percentatge de PN Mfn2cKO que mostraven un estat altament oxidat va augmentar més de tres vegades (Figura 5E), cosa que indica que la regulació a l'alça de PCx va mantenir la capacitat redox de les neurones degenerades.
(A) Un esquema que mostra el calendari experimental per a la injecció d'AAV que codifica shPCx quan s'activa la via metabòlica indicada. (B) Fotografies confocals representatives de seccions cerebel·loses de 8 setmanes en ratolins Mfn2cKO transduïts i marcats amb anticòs anti-calcineurina a les 4 setmanes. Barra d'escala, 450 μm. (C) Quantificació de la densitat de cèl·lules de Purkinje en bucles transduïts per AAV (anàlisi de la variància unidireccional; n = 3 a 4 ratolins). Les dades s'expressen com a mitjana ± SEM; ***P < 0,001. (D) La imatge FLIM representativa mostra la vida útil mitjana del sensor redox de glutatió Grx1-roGFP2 que expressa PN de 7 setmanes en les condicions experimentals especificades. Relació LUT (taula de cerca): interval de temps de supervivència (en picosegons). Barra d'escala, 25 μm. (E) L'histograma mostra la distribució dels valors de vida útil de Grx1-roGFP2 de (D) (n=158 a 368 cèl·lules en dos ratolins sota cada condició). El gràfic circular a sobre de cada histograma: mostra el nombre de cèl·lules amb valors de vida útil significativament més llargs (vermell, oxidat) o més curts (blau, reduït), que superen 1 desviació estàndard del valor mitjà de la vida útil en CTRL-AAV-scr. (F) El model proposat mostra l'efecte protector de la regulació a l'alça de la PCx neuronal.
En definitiva, les dades que proporcionem aquí mostren que la reexpressió de MFN2 pot rescatar completament la neurodegeneració avançada amb deficiència greu d'OXPHOS, depleció greu de mtDNA i morfologia extremadament anormal de tipus ista, proporcionant així un progrés continu fins i tot en malalties avançades. La neurodegeneració proporciona evidència reversible de l'etapa prèvia a la mort cel·lular. Aquest grau de flexibilitat metabòlica es veu reforçat per la capacitat de les neurones d'induir aterosclerosi (un recablejat del cicle TCA), que inhibeix l'expressió de PCx en neurones amb manca d'OXPHOS i potencia la mort cel·lular, jugant així un paper protector (Figura 5F).
En aquest estudi, hem proporcionat proves que la resposta de les neurones parenterals (NP) a la disfunció OXPHOS és convergir gradualment cap a l'aterosclerosi del cicle TCA a través de la via d'activació diferencial activada pels programes metabòlics. Hem confirmat l'anàlisi proteòmica amb molts mètodes complementaris i hem revelat que, quan es veuen desafiades per una disfunció mitocondrial greu, les neurones tenen una forma d'elasticitat metabòlica prèviament desconeguda. Per a la nostra sorpresa, tot el procés de recablejat no marca necessàriament l'estat metabòlic terminal que acompanya la neurodegeneració de manera gradual i irreversible, però les nostres dades suggereixen que pot constituir un mecanisme de compensació funcional de manteniment de les neurones fins i tot en l'etapa anterior a la mort cel·lular. Aquesta troballa indica que les neurones tenen un grau considerable de plasticitat metabòlica al cos. Aquest fet demostra que la reintroducció posterior de MFN2 pot revertir l'expressió de marcadors metabòlics clau i prevenir la degeneració de les NP. Al contrari, inhibeix l'aterosclerosi i accelera els nervis transsexuals.
Una de les troballes més fascinants de la nostra recerca és que les PN que no tenen OXPHOS poden modificar el metabolisme del cicle del TCA mitjançant la regulació a l'alça d'enzims que estimulen específicament l'arteriosclerosi. El reordenament metabòlic és una característica comuna de les cèl·lules canceroses, algunes de les quals depenen de la glutamina per complementar els intermediaris del cicle del TCA per produir equivalents reductors, que impulsen la cadena respiratòria i mantenen la producció de precursors de la biosíntesi de lípids i nucleòtids (39, 40). Un estudi recent va mostrar que en els teixits perifèrics que experimenten disfunció OXPHOS, la reconnexió del metabolisme de la glutamina/glutamat també és una característica destacada (5, 41), on la direcció de l'entrada de la glutamina al cicle del TCA depèn de la gravetat de la lesió OXPHOS (41). Tanmateix, hi ha una manca de proves clares sobre qualsevol similitud de la plasticitat metabòlica neuronal al cos i la seva possible rellevància en el context de la malaltia. En un estudi recent in vitro, es va demostrar que les neurones corticals primàries mobilitzaven reserves de glutamat per a la neurotransmissió, promovent així el metabolisme oxidatiu i l'aterosclerosi en condicions d'estrès metabòlic (42). Val a dir que sota la inhibició farmacològica de l'enzim succinat deshidrogenasa del cicle TCA, es creu que la carboxilació del piruvat manté la síntesi d'oxaloacetat en neurones granulars cerebel·loses cultivades (34). Tanmateix, la rellevància fisiològica d'aquests mecanismes per al teixit cerebral (on es creu que l'aterosclerosi es limita principalment als astròcits) encara té una importància fisiològica important (43). En aquest cas, les nostres dades mostren que les PN danyades per OXPHOS al cos poden canviar a la degradació de BCAA i la carboxilació del piruvat, que són les dues fonts principals de suplementació d'intermediaris del grup TCA. Tot i que s'ha proposat la suposada contribució del catabolisme de BCAA al metabolisme energètic neuronal, a més del paper del glutamat i el GABA per a la neurotransmissió (44), encara no hi ha proves d'aquests mecanismes in vivo. Per tant, és fàcil especular que les PN disfuncionals poden compensar automàticament el consum d'intermediaris TCA impulsat pel procés d'assimilació augmentant l'aterosclerosi. En particular, la regulació a l'alça de PCx pot ser necessària per mantenir una major demanda d'àcid aspàrtic, cosa que es suggereix en cèl·lules proliferatives amb disfunció mitocondrial (45). Tanmateix, la nostra anàlisi metabolòmica no va revelar cap canvi significatiu en el nivell d'estat estacionari d'àcid aspàrtic en les neurones particulades (PN) Mfn2cKO (Figura S6A), cosa que presumiblement reflecteix la diferent utilització metabòlica de l'àcid aspàrtic entre les cèl·lules proliferatives i les neurones postmitòtiques. Tot i que el mecanisme exacte de la regulació a l'alça de PCx en neurones disfuncionals in vivo encara no s'ha caracteritzat, vam demostrar que aquesta resposta prematura juga un paper important en el manteniment de l'estat redox de les neurones, cosa que es va demostrar en experiments FLIM en talls cerebel·losos. En particular, evitar que les PN regulin a l'alça la PCx pot conduir a un estat més oxidat i accelerar la mort cel·lular. L'activació de la degradació dels BCAA i la carboxilació del piruvat no són maneres de caracteritzar els teixits perifèrics de la disfunció mitocondrial (7). Per tant, semblen ser una característica prioritària de les neurones amb deficiència d'OXPHOS, tot i que no és l'única característica, que és important per a la neurodegeneració. .
La malaltia cerebel·losa és un tipus heterogeni de malaltia neurodegenerativa que normalment es manifesta com atàxia i sovint danya les PN (46). Aquesta població de neurones és particularment vulnerable a la disfunció mitocondrial perquè la seva degeneració selectiva en ratolins és suficient per reproduir molts dels símptomes motors que caracteritzen l'atàxia espinocerebel·losa humana (16, 47, 48). Segons els informes, un model de ratolí transgènic amb un gen mutant s'associa amb l'atàxia espinocerebel·losa humana i té disfunció mitocondrial (49, 50), cosa que emfatitza la importància d'estudiar les conseqüències de la deficiència d'OXPHOS en la PNPH. Per tant, és particularment adequat aïllar i estudiar eficaçment aquesta població neuronal única. Tanmateix, atès que les PN són molt sensibles a la pressió i representen una baixa proporció de tota la població de cèl·lules cerebel·loses, per a molts estudis basats en òmica, la separació selectiva d'elles com a cèl·lules senceres continua sent un aspecte desafiant. Tot i que és gairebé impossible aconseguir la manca absoluta de contaminació d'altres tipus de cèl·lules (especialment teixits adults), hem combinat un pas de dissociació eficaç amb FACS per obtenir un nombre suficient de neurones viables per a l'anàlisi proteòmica posterior, i tenim una cobertura de proteïnes força alta (unes 3000 proteïnes) en comparació amb el conjunt de dades existent de tot el cerebel (51). En preservar la viabilitat de cèl·lules senceres, el mètode que proporcionem aquí ens permet no només comprovar els canvis en les vies metabòliques dels mitocondris, sinó també comprovar els canvis en les seves contraparts citoplasmàtiques, cosa que complementa l'ús d'etiquetes de membrana mitocondrial per enriquir el tipus de cèl·lula. El nou mètode per al nombre de mitocondris en teixits complexos (52, 53). El mètode que descrivim no només està relacionat amb l'estudi de les cèl·lules de Purkinje, sinó que es pot aplicar fàcilment a qualsevol tipus de cèl·lula per abordar els canvis metabòlics en cervells malalts, inclosos altres models de disfunció mitocondrial.
Finalment, hem identificat una finestra terapèutica durant aquest procés de reordenació metabòlica que pot revertir completament els signes clau de l'estrès cel·lular i prevenir la degeneració neuronal. Per tant, comprendre les implicacions funcionals del recablejat descrit aquí pot proporcionar informació fonamental sobre possibles tractaments per mantenir la viabilitat neuronal durant la disfunció mitocondrial. Calen futures investigacions destinades a disseccionar els canvis en el metabolisme energètic en altres tipus de cèl·lules cerebrals per revelar completament l'aplicabilitat d'aquest principi a altres malalties neurològiques.
Els ratolins MitoPark s'han descrit anteriorment (31). Els ratolins C57BL/6N amb gens Mfn2 flanquejants amb loxP s'han descrit anteriorment (18) i es van creuar amb ratolins L7-Cre (23). La descendència doblement heterozigòtica resultant es va creuar amb ratolins Mfn2loxP/Mfn2loxP homozigòtics per generar eliminacions gèniques específiques de Purkinje per a Mfn2 (Mfn2loxP/Mfn2loxP; L7-cre). En un subconjunt d'aparellament, es va introduir l'al·lel Gt (ROSA26) SorStop-mito-YFP (stop-mtYFP) mitjançant encreuaments addicionals (20). Tots els procediments amb animals es van realitzar d'acord amb les directrius europees, nacionals i institucionals i van ser aprovats pel LandesamtfürNatur de Umwelt i Verbraucherschutz, Rin del Nord-Westfàlia, Alemanya. El treball amb animals també segueix les directrius de la Federació Europea d'Associacions de Ciències d'Animals de Laboratori.
Després d'anestesiar la luxació cervical de la dona embarassada, s'aïlla l'embrió de ratolí (E13). El còrtex es dissecciona en una solució salina equilibrada de Hanks (HBSS) suplementada amb 10 mM de Hepes i es passa per un medi d'Eagle modificat per Dulbecco que conté papaïna (20 U/ml) i cisteïna (1 μg/ml). S'incuba el teixit en DMEM (Ml) i es dissocia mitjançant digestió enzimàtica a 37 °C durant 20 minuts, i després es mol mecànicament en DMEM suplementat amb un 10% de sèrum fetal boví. Les cèl·lules es van sembrar en cobreobjectes de vidre recoberts amb polilisina a una densitat de 2 × 10⁶ per placa de cultiu de 6 cm o a una densitat de 0,5 × 10⁶ cèl·lules/cm² per a l'anàlisi d'imatges. Després de 4 hores, el medi es va substituir per un medi sense sèrum Neurobasal que conté un 1% de suplement de B27 i 0,5 mM de GlutaMax. Les neurones es van mantenir a 37 °C i al 5% de CO2 durant tot l'experiment i es van alimentar un cop per setmana. Per tal d'induir la recombinació in vitro, es van utilitzar 3 μl (placa de cultiu de 24 pous) o 0,5 μl (placa de 24 pous) del següent vector de virus AAV9 per tractar les neurones el segon dia in vitro: AAV9.CMV.PI.eGFP. WPRE.bGH (Addgene, número de catàleg 105530-AAV9) i AAV9.CMV.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (Addgene, número de catàleg 105545-AAV9).
L'ADN complementari de Mfn1 i Mfn2 de ratolí (obtingut del plasmidi Addgene #23212 i #23213, respectivament) està marcat amb la seqüència V5 (GKPINPLLGLDST) a l'extrem C-terminal i es fusiona amb mCherry en el marc de treball a través de la seqüència T2A. Grx1-roGFP2 és un regal de Heidelberg TP Dick DFKZ (Deutsches Krebsforschungszentrum). En substituir el casset tdTomato mitjançant mètodes de clonació convencionals, el casset es va subclonar a la cadena principal pAAV-CAG-FLEX-tdTomato (número de referència Addgene 28306) per generar els vectors pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5, pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN1-V5 i pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2. Es va utilitzar una estratègia similar per generar el vector de control pAAV-CAG-FLEX-mCherry. Per generar la construcció AAV-shPCx, es requereix un vector AAV plasmídic (VectorBuilder, pAAV [shRNA] -CMV-mCherry-U6-mPcx- [shRNA#1]), que conté la seqüència d'ADN que codifica el shRNA que dirigeix ​​la PCx de ratolí (5′CTTTCGCTCTAGGTGCTAAACTCGAGTTTAGCACCTTAGAGCGAAAG 3′). Sota el control del promotor U6, s'utilitza mCherry sota el control del promotor CMV. La producció de vectors AAV auxiliars es va dur a terme segons les instruccions del fabricant (Cell Biolabs). En resum, utilitzeu un plasmidi de transferència que porti el gen codificant mCherry-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5), mCherry-T2A-MFN1-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) transitòriament. Transfecció del gen codificant 293AAV cells-T2A-MFN1-V5), mCherry (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) o Grx-roGFP2 (pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2), així com la proteïna de la càpsida AAV1 i la proteïna accessòria. Plasmidi d'empaquetament, utilitzant el mètode de fosfat de calci. El sobrenedant del virus cru es va obtenir mitjançant cicles de congelació-descongelació en un bany de gel sec/etanol i les cèl·lules es van lisar en solució salina tamponada amb fosfat (PBS). El vector AAV es va purificar mitjançant ultracentrifugació en gradient discontinu de iodixanol (24 hores a 32.000 rpm i 4 °C) i es va concentrar utilitzant un filtre centrífug Amicon ultra-15. El títol genòmic d'AAV1-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5 [2,9 × 1013 còpia del genoma (GC)/ml], AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6,1 × 1012 GC/ml), AAV1-CAG-FLEX es va mesurar mitjançant PCR quantitativa en temps real (qPCR) -MFN1-V5 (1,9 × 1013 GC/ml) i AAV1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 (8,9 × 1012 GC/ml) com s'ha descrit anteriorment.
Les neurones primàries es van raspar en PBS 1x fred amb gel, es van sedimentar i després es van homogeneïtzar en tampó de lisi de Triton X-100 al 0,5% / desoxicolat de sodi al 0,5% / PBS que contenia fosfatasa i inhibidor de la proteasa (Roche). La quantificació de proteïnes es va realitzar mitjançant l'assaig d'àcid bicinconínic (Thermo Fisher Scientific). A continuació, les proteïnes es van separar mitjançant electroforesi en gel de SDS-poliacrilamida i després es van transferir a una membrana de fluorur de polivinilidè (GE Healthcare). Bloquegeu els llocs no específics i incubeu amb l'anticòs primari (vegeu la Taula S1 per a més detalls) en llet al 5% en TBST (solució salina tamponada amb Tris amb Tween), passos de rentat i anticòs secundari en incubació TBST. Incubeu amb l'anticòs primari durant la nit a +4 °C. Després del rentat, apliqueu l'anticòs secundari durant 2 hores a temperatura ambient. Posteriorment, incubant el mateix blot amb un anticòs anti-β-actina, es va confirmar la mateixa càrrega. Detecció mitjançant la conversió a quimioluminescència i l'augment de la quimioluminescència (GE Healthcare).
Les neurones sembrades prèviament en cobreobjectes de vidre es van fixar amb paraformaldehid (PFA) al 4%/PBS en el moment especificat a temperatura ambient durant 10 minuts. Els cobreobjectes es permeen primer amb Triton X-100/PBS al 0,1% durant 5 minuts a temperatura ambient i després en tampó de bloqueig [albúmina sèrica bovina (BSA) al 3%/PBS]. El segon dia, els cobreobjectes es van rentar amb tampó de bloqueig i es van incubar amb l'anticòs secundari conjugat amb fluoròfors apropiat durant 2 hores a temperatura ambient; finalment, les mostres es van rentar a fons en PBS amb 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), es van contratenyir i després es van fixar al portaobjectes de microscopi amb Aqua-Poly/Mount.
Es van anestesiar ratolins (mascles i femelles) mitjançant injecció intraperitoneal de ketamina (130 mg/kg) i xilazina (10 mg/kg) i se'ls va administrar per via subcutània analgèsic carprofèn (5 mg/kg), i es van col·locar en un instrument estereotàctic (Kopf) equipat amb una coixinet calenta. Es va exposar el crani i es va utilitzar un trepant dental per aprimar la part de l'escorça cerebel·losa corresponent a l'os secundària (de lambda: cua 1,8, lateral 1, corresponent als lòbuls IV i V). Es va utilitzar una agulla de xeringa corba per crear amb cura un petit forat al crani per evitar interrompre la vasculatura inferior. A continuació, s'insereix lentament el capil·lar de vidre prim estirat al microforat (de -1,3 a -1 al costat ventral de la duramàter) i s'injecten de 200 a 300 nl d'AAV al microinjector (Narishige) amb xeringues manuals (Narishige) diverses vegades a baixa pressió durant un període de temps de 10 a 20 minuts. Després de la infusió, col·loqueu el capil·lar durant 10 minuts més per permetre que el virus s'estengui completament. Un cop retirats els capil·lars, la pell es sutura amb cura per minimitzar la inflamació de la ferida i permetre que l'animal es recuperi. Els animals van ser tractats amb analgèsics (caspofèn) durant diversos dies després de l'operació, durant els quals es va controlar acuradament el seu estat físic i després van ser sacrificats en el moment indicat. Tots els procediments es van dur a terme d'acord amb les directrius europees, nacionals i institucionals i van ser aprovats pel LandesamtfürNatur de Umwelt i Verbraucherschutz, Rin del Nord-Westfàlia, Alemanya.
Els animals van ser anestesiats amb ketamina (100 mg/kg) i xilazina (10 mg/kg), i el cor es va perfondre primer amb PBS 0,1 M i després amb PFA al 4% en PBS. El teixit es va disseccionar i fixar en PFA/PBS al 4% durant la nit a 4 °C. Es va utilitzar un ganivet vibratori (Leica Microsystems GmbH, Viena, Àustria) per preparar seccions sagitals (50 μm de gruix) del cervell fixat en PBS. Si no s'especifica el contrari, la tinció de les seccions flotants es va realitzar tal com s'ha descrit anteriorment (13) a temperatura ambient i agitant. En resum, primer, les llesques obtingudes es van permeabilitzar amb Triton X-100/PBS al 0,5% durant 15 minuts a temperatura ambient; per a alguns epítops (Pcx i Shmt2), escalfant les llesques durant 25 minuts en tampó tris-EDTA a 80 °C (PH 9) en lloc d'aquest pas. A continuació, les seccions es van incubar amb anticòs primari (vegeu la taula S1) en tampó de bloqueig (3% BSA/PBS) a 4 °C durant tota la nit amb agitació. L'endemà, les seccions es van rentar amb tampó de bloqueig i es van incubar amb l'anticòs secundari conjugat amb fluoròfor apropiat durant 2 hores a temperatura ambient; finalment, les seccions es van rentar a fons en PBS, es van contratenyir amb DAPI i després es van fixar amb AquaPolymount en un portaobjectes de microscopi.
Per obtenir imatges de la mostra es va utilitzar un microscopi confocal de rastreig làser (TCS SP8-X o TCS Digital Light Sheet, Leica Microsystems) equipat amb un làser de llum blanca i un làser ultraviolat de díodes de 405. En excitar el fluoròfor i recollir el senyal amb un detector híbrid (HyDs), es va utilitzar el programari LAS-X per recollir imatges apilades d'acord amb el mostreig de Nyquist en mode seqüencial: per a panells no quantitatius, es tracta de senyals altament dinàmics (per exemple, en cèl·lules somàtiques i dendrites) (mtYFP) Utilitzeu HyD per detectar el nombre de PN en mode BrightR). S'aplica una porta de 0,3 a 6 ns per reduir el fons.
Imatges en temps real de cèl·lules classificades. Després de la classificació en medi Neurobasal-A que contenia un 1% de suplement de B27 i 0,5 mM de GlutaMax, les cèl·lules es van sembrar immediatament en portaobjectes de vidre recoberts de poli-l-lisina (μ-Slide8 Well, Ibidi, número de catàleg 80826), i després es van mantenir a 37 °C i un 5% de CO2 durant 1 hora per permetre que les cèl·lules s'assentessin. Les imatges en temps real es van realitzar en un microscopi confocal de rastreig làser Leica SP8 equipat amb un làser blanc, HyD, una lent objectiu d'oli de 63 × [1,4 obertura numèrica (NA)] i una etapa d'escalfament.
El ratolí va ser anestesiat ràpidament amb diòxid de carboni i decapitat, el cervell es va extreure ràpidament del crani i es va tallar en seccions sagitals de 200 μm de gruix (per a l'experiment de marcatge amb 13C) o 275 μm de gruix (per a experiments de dos fotons) omplertes amb els següents materials. El gelat (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Alemanya) s'omple amb les següents substàncies: NaCl baix en Ca2 + líquid cefaloraquidi artificial (ACSF) saturat en carboni i fred com a gel, 125 mM, KCl 2,5 mM, tampó fosfat de sodi 1,25 mM, NaHCO3 25 mM, glucosa 25 mM, CaCl2 0,5 mM i MgCl2 3,5 mM (pressió osmòtica de 310 a 330 mmol). Transferiu els talls de cervell obtinguts a una cambra de preincubació que conté un medi amb concentracions més altes de Ca2 + ACSF (125,0 mM de NaCl, 2,5 mM de KCl, 1,25 mM de tampó fosfat de sodi, 25,0 mM de NaHCO3, 25,0 mM de d-glucosa, 1,0 mM de CaCl2 i 2,0 mM de MgCl2), pH 7,4 i 310 a 320 mmol.
Durant el procés d'obtenció d'imatges, els talls es van traslladar a una sala d'obtenció d'imatges dedicada i l'experiment es va dur a terme sota perfusió contínua d'ACSF a una temperatura constant de 32° a 33°C. Per a l'obtenció d'imatges de talls es va utilitzar un microscopi làser multifotònic d'escaneig (TCS SP8 MP-OPO, Leica Microsystems) equipat amb una lent objectiu Leica 25x (NA 0.95, aigua) i un làser de Ti:Safir (Chameleon Vision II, Coherent). Mòdul FLIM (PicoHarp300, PicoQuant).
FLIM de Grx1-roGFP2. Els canvis en l'estat redox citoplasmàtic de les PN es van mesurar mitjançant FLIM de dos fotons en talls sagitals de cervell, on el biosensor Grx1-roGFP2 es va dirigir a les PN. A la capa de PN, el camp d'adquisició es selecciona uns 50 a 80 μm per sota de la superfície del tall per garantir que hi hagi una PN viable (és a dir, la manca d'estructura en perles o canvis morfològics neuronals al llarg de les dendrites) i el sensor roGFP2 doble positiu i l'AAV que codifiquen shRNA PCx o la seva seqüència de control (cadascun coexpressa mCherry). Recopilar imatges de pila única amb zoom digital 2x [longitud d'ona d'excitació: 890 nm; 512 nm 512 píxels]. Detecció: HyD interna, grup de filtre d'isotiocianat de fluoresceïna (FITC)] i promediació d'imatges en 2 a 3 minuts s'utilitzen per garantir que es recopilin prou fotons (1000 fotons en total) per a l'ajust de la corba. La sensibilitat de la sonda Grx1-roGFP2 i la verificació de les condicions FLIM es van dur a terme monitoritzant el valor de la vida útil de roGFP2 en afegir 10 mM d'H2O2 exògen a l'ACSF de perfusió (per maximitzar l'oxidació, resultant en una vida útil més llarga), i després afegir 2 mM de ditiotreitol (minimitza el grau de reducció, resultant en una disminució de la vida útil) (Figura S8, D a G). Utilitzeu el programari FLIMfit 5.1.1 per analitzar els resultats adquirits, ajusteu la corba de decaïment exponencial única de tota la imatge a l'IRF mesurada (funció de resposta de l'instrument) i χ2 és aproximadament 1. Per calcular la vida útil d'una sola PN, es va dibuixar manualment la màscara al voltant del cos del nervi i es va utilitzar la vida útil mitjana de cada màscara per a la quantificació.
Anàlisi del potencial mitocondrial. Després que la secció aguda s'incubés amb 100 nM de TMRM afegit directament a l'ACSF perfós durant 30 minuts, els canvis de potencial mitocondrial de les PN es van mesurar mitjançant un microscopi de dos fotons. La imatge TMRM es va realitzar excitant la sonda a 920 nm i utilitzant HyD interna (isotiocianat de tetrametilrodamina: 585/40 nm) per recollir senyals; utilitzant la mateixa longitud d'ona d'excitació però utilitzant una HyD interna diferent (FITC: 525/50) per obtenir imatges de mtYFP. Utilitzeu el complement Image Calculator d'ImageJ per avaluar el potencial mitocondrial a nivell de cèl·lula individual. En resum, l'equació del complement: senyal = min (mtYFP, TMRM) s'utilitza per identificar la regió mitocondrial que mostra el senyal TMRM en Purkinje Somali a la imatge confocal de pila única del canal corresponent. A continuació, es quantifica l'àrea de píxels de la màscara resultant i es normalitza a la imatge de pila única del llindar corresponent del canal mtYFP per obtenir la fracció mitocondrial que mostra el potencial mitocondrial.
La imatge es va deconvolucionar amb el programari Huygens Pro (Scientific Volume Imaging). Per a les imatges escanejades de rajoles, el muntatge d'una sola teula es fa mitjançant l'algoritme de costura automàtica proporcionat pel programari LAS-X. Després de la calibració de la imatge, utilitzeu ImageJ i Adobe Photoshop per processar més la imatge i ajustar uniformement la brillantor i el contrast. Utilitzeu Adobe Illustrator per a la preparació gràfica.
Anàlisi de focus de mtDNA. El nombre de lesions de mtDNA es va quantificar en seccions cerebel·loses marcades amb anticossos contra l'ADN mitjançant microscopi confocal. Cada àrea diana es va crear per al cos cel·lular i el nucli de cada cèl·lula, i l'àrea respectiva es va calcular mitjançant el connector Multi Measure (programari ImageJ). Resteu l'àrea nuclear de l'àrea del cos cel·lular per obtenir l'àrea citoplasmàtica. Finalment, es va utilitzar el connector Analyze Particles (programari ImageJ) per quantificar automàticament els punts d'ADN citoplasmàtic que indiquen mtDNA a la imatge llindar, i els resultats obtinguts es van normalitzar a la mitjana PN dels ratolins CTRL. Els resultats s'expressen com el nombre mitjà de nucleòsids per cèl·lula.
Anàlisi de l'expressió de proteïnes. Utilitzeu el complement Image Calculator d'ImageJ per avaluar l'expressió de proteïnes en PN a nivell de cèl·lula individual. En resum, a la imatge confocal d'una sola capa del canal corresponent, mitjançant l'equació: senyal = min (mtYFP, anticòs), s'identifica la regió mitocondrial que mostra immunoreactivitat a un determinat anticòs en Purkina. A continuació, es quantifica l'àrea de píxels de la màscara resultant i es normalitza a la imatge de pila única de llindar corresponent del canal mtYFP per obtenir la fracció mitocondrial de la proteïna mostrada.
Anàlisi de la densitat de cèl·lules de Purkinje. El complement Cell Counter d'ImageJ es va utilitzar per avaluar la densitat de Purkinje dividint el nombre de cèl·lules de Purkinje comptades per la longitud de l'anell cerebel·lós ocupat per les cèl·lules comptades.
Preparació i recollida de mostres. Els cervells del grup de control i dels ratolins Mfn2cKO es van fixar en un 2% de PFA/2,5% de glutaraldehid en tampó fosfat (PB) 0,1 M, i després es van preparar seccions coronals utilitzant ciliats (Leica Mikrosysteme GmbH, Viena, Àustria) (gruix de 50 a 60 μm). A continuació, es van fixar en tampó PB en tetraòxid d'os a l'1% i ferrocianur de potassi a l'1,5% a temperatura ambient durant 1 hora. Les seccions es van rentar tres vegades amb aigua destil·lada i després es van tenyir amb etanol al 70% que contenia acetat d'uranil a l'1% durant 20 minuts. A continuació, les seccions es van deshidratar en alcohol graduat i es van incrustar en resina epoxi Durcupan ACM (resina de fosa Araldite M) (Electron Microscopy Sciences, número de catàleg 14040) entre portaobjectes de vidre recoberts de silicona, i finalment es van polimeritzar al forn a 60 °C durant 48 hores. Es va seleccionar la zona de l'escorça cerebel·losa i es van tallar seccions ultrafines de 50 nm amb Leica Ultracut (Leica Mikrosysteme GmbH, Viena, Àustria) i es van recollir en una reixeta de coure de 2×1 mm recoberta amb pel·lícula de poliestirè. Les seccions es van tenyir amb una solució d'acetat d'uranil al 4% en H2O durant 10 minuts, es van rentar amb H2O diverses vegades, després amb citrat de plom de Reynolds en H2O durant 10 minuts i després es van rentar amb H2O diverses vegades. Es van prendre micrografies amb un microscopi electrònic de transmissió Philips CM100 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA) utilitzant una càmera digital TVIPS (Tietz Video and Image Processing System) TemCam-F416 (TVIPS GmbH, Gauting, EUA). Alemanya).
Per als ratolins infectats amb AAV, es va separar el cervell i es va tallar en una secció sagital d'1 mm de gruix, i es va examinar el cerebel amb un microscopi de fluorescència per identificar l'anell infectat amb AAV (és a dir, que expressava mCherry). Només s'utilitzen experiments en què la injecció d'AAV resulta en una eficiència de transducció molt alta de la capa de cèl·lules de Purkinje (és a dir, gairebé tota la capa) en almenys dos anells cerebel·losos consecutius. El bucle transduït per AAV es va microdisseccionar per a la postfixació durant la nit (4% PFA i 2,5% glutaraldehid en tampó cocoat 0,1 M) i es va processar posteriorment. Per a la inclusió d'EPON, el teixit fixat es va rentar amb tampó cocoat de sodi 0,1 M (Applicihem) i es va incubar amb un 2% OsO4 (os, Science Services; Caco) en tampó cocoat de sodi 0,1 M (Applicihem) durant 4 hores, i després es va rentar durant 2 hores. Repetir 3 vegades amb tampó de cocamida 0,1 M. Posteriorment, es va utilitzar la sèrie ascendent d'etanol per incubar cada solució d'etanol a 4 °C durant 15 minuts per deshidratar el teixit. El teixit es va transferir a òxid de propilè i es va incubar durant la nit en EPON (Sigma-Aldrich) a 4 °C. Es va col·locar el teixit en EPON fresc a temperatura ambient durant 2 hores i després es va incrustar a 62 °C durant 72 hores. Es va utilitzar un ultramicrotom (Leica Microsystems, UC6) i un ganivet de diamant (Diatome, Biel, Suïssa) per tallar seccions ultrafines de 70 nm i es van tenyir amb acetat d'uranil a l'1,5% durant 15 minuts a 37 °C i es van tenyir amb una solució de citrat de plom durant 4 minuts. Les micrografies electròniques es van prendre amb un microscopi electrònic de transmissió JEM-2100 Plus (JEOL) equipat amb Camera OneView 4K de 16 bits (Gatan) i programari DigitalMicrograph (Gatan). Per a l'anàlisi, es van adquirir micrografies electròniques amb zoom digital de 5000× o 10.000×.
Anàlisi morfològica dels mitocondris. Per a totes les anàlisis, els contorns dels mitocondris individuals es van perfilar manualment en imatges digitals mitjançant el programari ImageJ. S'analitzen diferents paràmetres morfològics. La densitat mitocondrial s'expressa com un percentatge obtingut dividint l'àrea mitocondrial total de cada cèl·lula per l'àrea del citoplasma (àrea del citoplasma = àrea cel·lular - àrea del nucli cel·lular) × 100. La rodonesa dels mitocondris es calcula amb la fórmula [4π∙(àrea/perímetre 2)]. Es va analitzar la morfologia dels mitocondris i es va dividir en dues categories ("tubular" i "butícola") segons les seves formes principals.
Anàlisi del nombre i la densitat d'autofagosomes/lisosomes. Utilitzeu el programari ImageJ per delinear manualment els contorns de cada autofagosoma/lisosoma a la imatge digital. L'àrea de l'autofagosoma/lisosoma s'expressa com un percentatge que es calcula dividint l'àrea total de l'estructura de l'autofagosoma/lisosoma de cada cèl·lula per l'àrea del citoplasma (àrea del citoplasma = àrea cel·lular - àrea del nucli) × 100. La densitat d'autofagosomes/lisosomes es calcula dividint el nombre total pel nombre d'estructures d'autofagosomes/lisosomes per cèl·lula (en termes d'àrea citoplasmàtica) (àrea citoplasmàtica = àrea cel·lular - àrea nuclear).
Etiquetatge per a la secció aguda i la preparació de mostres. Per a experiments que requereixen marcatge amb glucosa, transferiu els talls de cervell aguts a una cambra de preincubació, que conté carboni saturat (95% O2 i 5% CO2), ACSF alt en Ca2 + (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM tampó fosfat de sodi, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glucosa, 1,0 mM CaCl2 i 2,0 mM MgCl2, ajustat a pH 7,4 i 310 a 320 mOsm), en què la glucosa és substitució de glucosa 13C6- (Eurisotop, número de catàleg CLM-1396). Per a experiments que requereixen marcatge amb piruvat, transferiu les seccions de cervell agudes a una solució més alta de Ca2 + ACSF (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM tampó de fosfat de sodi, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glucosa, 1,0 mM CaCl2 i afegiu-hi 2,0 mM MgCl2, ajusteu-ho a pH 7,4 i de 310 a 320 mOsm) i afegiu-hi 1 mM d'1-[1-13C]piruvat (Eurisotop, número de catàleg CLM-1082). Incubeu les seccions durant 90 minuts a 37 °C. Al final de l'experiment, les seccions es van rentar ràpidament amb una solució aquosa (pH 7,4) que contenia 75 mM de carbonat d'amoni i després es van homogeneïtzar en acetonitril (ACN):metanol:aigua 40:40:20 (v:v:v). Després d'incubar les seccions en gel durant 30 minuts, les mostres es van centrifugar a 21.000 g durant 10 minuts a 4 °C i el sobrenedant transparent es va assecar en un concentrador SpeedVac. El pellet de metabòlits sec resultant es va emmagatzemar a -80 °C fins a l'anàlisi.
Anàlisi per cromatografia líquida-espectrometria de masses d'aminoàcids marcats amb 13 C. Per a l'anàlisi per cromatografia líquida-espectrometria de masses (LC-MS), el pellet de metabòlits es va resuspendre en 75 μl d'aigua de grau LC-MS (Honeywell). Després de centrifugar a 21.000 g durant 5 minuts a 4 °C, es van utilitzar 20 μl del sobrenedant clarificat per a l'anàlisi del flux d'aminoàcids, mentre que la resta de l'extracte es va utilitzar immediatament per a l'anàlisi d'anions (vegeu més avall). L'anàlisi d'aminoàcids es va realitzar mitjançant el protocol de derivatització del clorur de benzoil descrit anteriorment (55, 56). En el primer pas, es van afegir 10 μl de carbonat de sodi 100 mM (Sigma-Aldrich) a 20 μl d'extracte de metabòlits i, a continuació, es van afegir 10 μl de clorur de benzoil al 2% (Sigma-Aldrich) a l'ACN de grau LC. La mostra es va vortexar breument i després es va centrifugar a 21.000 g durant 5 minuts a 20 °C. Transferir el sobrenedant aclarit a un vial d'automostrejador de 2 ml amb un insert de vidre cònic (volum de 200 μl). Les mostres es van analitzar mitjançant el sistema LC d'ultra alt rendiment Acquity iClass (Waters) connectat a l'espectròmetre de masses de precisió d'alta resolució Q-Exactive (QE)-HF (Ultra High Field Orbitrap) (Thermo Fisher Scientific). Per a l'anàlisi, es van injectar 2 μl de la mostra derivatitzada en una columna de sílice T3 d'alta resistència de 100 × 1,0 mm (Waters) que contenia partícules d'1,8 μm. El cabal és de 100 μl/min i el sistema tampó consisteix en tampó A (10 mM de formiat d'amoni i 0,15% d'àcid fòrmic en aigua) i tampó B (ACN). El gradient és el següent: 0% B als 0 minuts; 0% B. 0 a 15% B entre 0 i 0,1 minuts; 15 a 17% B entre 0,1 i 0,5 minuts; B entre 17 i 55% entre 0,5 i 14 minuts; B entre 55 i 70% entre 14 i 14,5 minuts; 14,5 a 70 a 100% B entre 18 minuts; 100% B entre 18 i 19 minuts; 100 a 0% B entre 19 i 19,1 minuts; 0% B entre 19,1 i 28 minuts (55, 56). L'espectròmetre de masses QE-HF funciona en mode d'ionització positiva amb un rang de masses de m/z (relació massa/càrrega) de 50 a 750. La resolució aplicada és de 60.000, i l'objectiu d'ions de control de guany (AGC) obtingut és de 3×106, i el temps màxim d'ions és de 100 mil·lisegons. La font d'ionització per electroaspersió (ESI) escalfada funciona a una tensió d'aspersió de 3,5 kV, una temperatura capil·lar de 250 °C, un flux d'aire de la beina de 60 UA (unitats arbitràries) i un flux d'aire auxiliar de 20 UA a 250 °C. La lent S està ajustada a 60 UA.
Anàlisi per cromatografia aniònica-MS d'àcids orgànics marcats amb 13C. El precipitat de metabòlit restant (55 μl) es va analitzar mitjançant un sistema de cromatografia iònica Dionex (ICS 5000+, Thermo Fisher Scientific) connectat a un espectròmetre de masses QE-HF (Thermo Fisher Scientific). En resum, es van injectar 5 μl d'extracte de metabòlit en una columna Dionex IonPac AS11-HC equipada amb HPLC (2 mm × 250 mm, mida de partícula 4 μm, Thermo Fisher Scientific) en mode de bucle parcial push-in amb una relació d'ompliment d'1.) Columna de guarda Dionex IonPac AG11-HC (2 mm x 50 mm, 4 μm, Thermo Fisher Scientific). La temperatura de la columna es manté a 30 °C i l'automostrejador s'estableix a 6 °C. Utilitzeu un cartutx d'hidròxid de potassi proveït d'aigua desionitzada per generar un gradient d'hidròxid de potassi a través del generador d'eluent. Separació de metabòlits a un cabal de 380 μl/min, aplicant el següent gradient: de 0 a 3 minuts, 10 mM KOH; de 3 a 12 minuts, 10 a 50 mM KOH; de 12 a 19 minuts, 50 a 100 mM KOH; de 19 a 21 minuts, 100 mM KOH; de 21 a 21,5 minuts, 100 a 10 mM KOH. La columna es va reequilibrar amb 10 mM KOH durant 8,5 minuts.
Els metabòlits eluïts es combinen amb un corrent de suplement d'isopropanol de 150 μl/min després de la columna i després es dirigeixen a un espectròmetre de masses d'alta resolució que funciona en mode d'ionització negativa. L'espectròmetre de masses (MS) monitoritza el rang de masses de m/z 50 a 750 amb una resolució de 60.000. L'AGC s'estableix a 1×106 i el temps màxim d'ions es manté a 100 ms. La font ESI escalfada es va operar a una tensió de polvorització de 3,5 kV. Els altres ajustos de la font d'ions són els següents: temperatura capil·lar 275 °C; flux de gas de la beina, 60 AU; flux de gas auxiliar, 20 AU a 300 °C i ajust de la lent S a 60 AU.
Anàlisi de dades de metabòlits marcats amb 13C. Utilitzeu el programari TraceFinder (versió 4.2, Thermo Fisher Scientific) per a l'anàlisi de dades de la proporció isotòpica. La identitat de cada compost es va verificar mitjançant un compost de referència fiable i es va analitzar de manera independent. Per tal de realitzar l'anàlisi d'enriquiment isotòpic, l'àrea del cromatograma d'ions extret (XIC) de cada isòtop 13C (Mn) es va extreure de [M + H] +, on n és el nombre de carboni del compost diana, utilitzat per analitzar aminoàcids o [MH] + s'utilitza per analitzar anions. La precisió en massa del XIC és inferior a cinc parts per milió, i la precisió del temps de transcripció és de 0,05 minuts. L'anàlisi d'enriquiment es realitza calculant la proporció de cada isòtop detectat respecte a la suma de tots els isòtops del compost corresponent. Aquestes proporcions es donen com a valors percentuals per a cada isòtop, i els resultats s'expressen com a percentatge d'enriquiment molar (MPE), tal com s'ha descrit anteriorment (42).
El pellet de neurones congelat es va homogeneïtzar en metanol al 80% (v/v) fred amb gel, es va vortexar i es va incubar a -20 °C durant 30 minuts. Es va tornar a vortexar la mostra i es va remenar a +4 °C durant 30 minuts. La mostra es va centrifugar a 21.000 g durant 5 minuts a 4 °C i, a continuació, es va recollir el sobrenedant resultant i es va assecar amb un concentrador SpeedVac a 25 °C per a la seva posterior anàlisi. Com s'ha descrit anteriorment, es va realitzar una anàlisi LC-MS dels aminoàcids de les cèl·lules classificades. Utilitzant TraceFinder (versió 4.2, Thermo Fisher Scientific), es va realitzar l'anàlisi de dades utilitzant la massa monoisotòpica de cada compost. La normalització quàntica de les dades dels metabòlits es va realitzar mitjançant el paquet de programari preprocessCore (57).
Preparació de les llesques. El ratolí va ser anestesiat ràpidament amb diòxid de carboni i decapitat, el cervell es va extreure ràpidament del crani i es va utilitzar el ganivet vibratori ple de gel (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Alemanya) per tallar-lo en seccions sagitals de 300 a 375 μm. Gasificació amb carboni fred (95% O2 i 5% CO2). Baix contingut de Ca2 + ACSF (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM tampó fosfat de sodi, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glucosa, 1,0 mM CaCl2 i 6,0 mM MgCl2. Ajustar a pH 7,4 i 310 a 330 mOsm). Transferiu els talls de cervell obtinguts a una cambra que contingui una concentració més alta de Ca2 + ACSF (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM tampó de fosfat de sodi, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glucosa, 4,0 mM CaCl2 i 3,5 mM MgCl2) pH 7,4 i 310 a 320 mOsm). Guardeu els talls durant 20 a 30 minuts perquè es puguin restaurar abans de registrar-los.
enregistrament. Per a tots els enregistraments es va utilitzar una platina de microscopi equipada amb una cambra d'enregistrament fixa i una lent objectiu d'immersió en aigua de 20x (Scientifica). Les suposades cèl·lules de Purkinje es van identificar per (i) la mida corporal, (ii) la ubicació anatòmica del cerebel i (iii) l'expressió del gen reporter mtYFP fluorescent. La pipeta de pegat amb una resistència de punta de 5 a 11 megohms s'extreu mitjançant un capil·lar de vidre de borosilicat (GB150-10, 0,86 mm × 1,5 mm × 100 mm, Science Products, Hofheim, Alemanya) i una pipeta horitzontal Instruments (P-1000, Sutter), Novato, CA). Tots els enregistraments es van realitzar mitjançant un amplificador de pinça de pegat npi ELC-03XS (npi electronic GmbH, Tam, Alemanya), que estava controlat pel programari Signal (versió 6.0, Cambridge Electronic, Cambridge, Regne Unit). L'experiment es va enregistrar a una freqüència de mostreig de 12,5 kHz. El senyal es filtra amb dos filtres Bessel de pas curt amb freqüències de tall d'1,3 i 10 kHz respectivament. La capacitància de la membrana i la pipeta es compensa mitjançant el circuit de compensació utilitzant l'amplificador. Tots els experiments es van dur a terme sota el control d'una càmera Orca-Flash 4.0 (Hamamatsu, Gerden, Alemanya), que estava controlada pel programari Hokawo (versió 2.8, Hamamatsu, Gerden, Alemanya).
Configuració i anàlisi rutinària de cèl·lules senceres. Immediatament abans del registre, ompliu la pipeta amb la solució interna que conté les substàncies següents: 4,0 mM KCl, 2,0 mM NaCl, 0,2 mM EGTA, 135,0 mM gluconat de potassi, 10,0 mM Hepes, 4,0 mM ATP (Mg), 0,5 mM trifosfat de guanosina (GTP) (Na) i 10,0 mM fosfat de creatinina es van ajustar a pH 7,25, i la pressió osmòtica va ser de 290 mOsm (sacarosa). Immediatament després d'aplicar una força de 0 pA per trencar la membrana, es va mesurar el potencial de membrana en repòs. La resistència d'entrada es mesura aplicant corrents hiperpolaritzats de -40, -30, -20 i -10 pA. Mesureu la magnitud de la resposta de voltatge i utilitzeu la llei d'Ohm per calcular la resistència d'entrada. L'activitat espontània es va registrar en una pinça de voltatge durant 5 minuts, i la sPSC es va identificar i mesurar a Igor Pro (versió 32 7.01, WaveMetrics, Lake Oswego, Oregon, EUA) mitjançant un script de reconeixement semiautomàtic. La corba IV i el corrent d'estat estacionari es mesuren fixant la bateria a diferents potencials (començant des de -110 mV) i augmentant el voltatge en passos de 5 mV. La producció de PA es va provar aplicant un corrent despolaritzant. Fixeu la cel·la a -70 mV mentre apliqueu un pols de corrent despolaritzant. Ajusteu la mida del pas de cada unitat de registre per separat (de 10 a 60 pA). Calculeu la freqüència màxima de PA comptant manualment els pics de pols que causen la freqüència de PA més alta. El llindar de PA s'analitza mitjançant la segona derivada del pols de despolarització que primer activa un o més PA.
Configuració i anàlisi del pegat perforat. Realitzeu un registre del pegat perforat mitjançant protocols estàndard. Utilitzeu una pipeta sense ATP ni GTP que no contingui els ingredients següents: 128 mM de gluconat K, 10 mM de KCl, 10 mM de Hepes, 0,1 mM d'EGTA i 2 mM de MgCl2, i ajusteu-ho a pH 7,2 (utilitzant KOH). L'ATP i el GTP s'ometen de la solució intracel·lular per evitar la permeabilitat incontrolada de la membrana cel·lular. La pipeta del pegat s'omple amb una solució interna que conté amfotericina (aproximadament de 200 a 250 μg/ml; G4888, Sigma-Aldrich) per obtenir un registre del pegat perforat. L'amfotericina es va dissoldre en dimetilsulfòxid (concentració final: 0,1 a 0,3%; DMSO; D8418, Sigma-Aldrich). La concentració de DMSO utilitzada no va tenir cap efecte significatiu sobre les neurones estudiades. Durant el procés de perforació, la resistència del canal (Ra) es va monitoritzar contínuament i l'experiment es va iniciar després que l'amplitud de Ra i AP s'estabilitzessin (20-40 minuts). L'activitat espontània es mesura en una pinça de voltatge i/o corrent durant 2 a 5 minuts. L'anàlisi de dades es va realitzar mitjançant Igor Pro (versió 7.05.2, WaveMetrics, EUA), Excel (versió 2010, Microsoft Corporation, Redmond, EUA) i GraphPad Prism (versió 8.1.2, GraphPad Software Inc., La Jolla, CA (Estats Units). Per identificar els AP espontanis, s'utilitza el complement NeuroMatic v3.0c d'IgorPro. Identifiqueu automàticament els AP mitjançant un llindar determinat, que s'ajusta individualment per a cada registre. Utilitzant l'interval de pic, determineu la freqüència de pic amb la freqüència de pic instantània màxima i la freqüència de pic mitjana.
Aïllament de PN. Adaptant-se al protocol publicat anteriorment, les PN es van purificar del cerebel de ratolí en una etapa especificada (58). En resum, el cerebel es va disseccionar i trossejar en un medi de dissociació gelat [sense HBSS Ca2+ ni Mg2+, suplementat amb 20 mM de glucosa, penicil·lina (50 U/ml) i estreptomicina (0,05 mg/ml)], i després es va digerir el medi en papaïna [HBSS, suplementat amb 1-cisteïna·HCl (1 mg/ml), papaïna (16 U/ml) i desoxiribonucleasa I (DNasa I; 0,1 mg/ml)]. Tractar durant 30 minuts a 30 °C. Primer renteu els teixits en un medi HBSS que conté moc d'ou (10 mg/ml), BSA (10 mg/ml) i DNasa (0,1 mg/ml) a temperatura ambient per evitar la digestió enzimàtica, i després en el medi HBSS que conté 20 mM de glucosa. Tritureu suaument en HBSS, penicil·lina (50 U/ml), estreptomicina (0,05 mg/ml) i DNasa (0,1 mg/ml) per alliberar cèl·lules individuals. La suspensió cel·lular resultant es va filtrar a través d'un colador cel·lular de 70 μm, després les cèl·lules es van pelletar per centrifugació (1110 rpm, 5 minuts, 4 °C) i es van resuspendre en un medi de classificació [HBSS, suplementat amb 20 mM de glucosa, sèrum fetal boví al 20%), penicil·lina (50 U/ml) i estreptomicina (0,05 mg/ml)]; avalueu la viabilitat cel·lular amb iodur de propidi i ajusteu la densitat cel·lular a 1 × 10⁶ a 2 × 10⁶ cèl·lules/ml. Abans de la citometria de flux, la suspensió es va filtrar a través d'un colador cel·lular de 50 μm.
Citòmetre de flux. La classificació cel·lular es va realitzar a 4 °C mitjançant la màquina FACSAria III (BD Biosciences) i el programari FACSDiva (BD Biosciences, versió 8.0.1). La suspensió cel·lular es va classificar mitjançant una boquilla de 100 μm sota una pressió de 20 psi a una velocitat de ~2800 esdeveniments/sec. Com que els criteris de comporta tradicionals (mida de la cèl·lula, discriminació bimodal i característiques de dispersió) no poden garantir l'aïllament correcte de la PN d'altres tipus de cèl·lules, l'estratègia de comporta s'estableix en funció de la comparació directa de la intensitat i l'autofluorescència de la YFP en els ratolins mitoYFP+ ​​i els ratolins de control mitoYFP−. La YFP s'excita irradiant la mostra amb una línia làser de 488 nm i el senyal es detecta mitjançant un filtre de passada de banda de 530/30 nm. En els ratolins mitoYFP+, la força relativa del gen reporter Rosa26-mitoYFP també s'utilitza per distingir els fragments del cos neuronal i dels axons. El 7-AAD s'excita amb un làser groc de 561 nm i es detecta amb un filtre de pas de banda de 675/20 nm per excloure les cèl·lules mortes. Per tal de separar els astròcits alhora, la suspensió cel·lular es va tenyir amb ACSA-2-APC, després la mostra es va irradiar amb una línia làser de 640 nm i es va utilitzar un filtre de pas de banda de 660/20 nm per detectar el senyal.
Les cèl·lules recollides es van sedimentar per centrifugació (1110 rpm, 5 minuts, 4 °C) i es van emmagatzemar a -80 °C fins al seu ús. Els ratolins Mfn2cKO i les seves cries es classifiquen el mateix dia per minimitzar la variabilitat procedimental. La presentació i l'anàlisi de dades FACS es van realitzar mitjançant el programari FlowJo (FlowJo LLC, Ashland, Oregon, EUA).
Com s'ha esmentat anteriorment (59), la PCR en temps real s'utilitza per aïllar l'ADN de les neurones classificades per a la posterior quantificació de l'ADNmt. La linealitat i la sensibilitat llindar es van provar inicialment executant qPCR en diferents nombres de cèl·lules. En resum, recollir 300 PN en un tampó de lisi que consisteix en 50 mM de tris-HCl (pH 8,5), 1 mM d'EDTA, 0,5% de Tween 20 i proteinasa K (200 ng/ml) i incubar a 55 °C durant 120 minuts. Les cèl·lules es van incubar més a 95 °C durant 10 minuts per garantir la inactivació completa de la proteinasa K. Utilitzant una sonda TaqMan (Thermo Fisher) específica per a mt-Nd1, l'ADNmt es va mesurar mitjançant PCR semiquantitativa en el sistema de PCR en temps real 7900HT (Thermo Fisher Scientific). Science, número de catàleg Mm04225274_s1), mt-Nd6 (Thermo Fisher Scientific, número de catàleg AIVI3E8) i gens 18S (Thermo Fisher Scientific, número de catàleg Hs99999901_s1).
Preparació de la mostra de proteoma. Escalfant la solució a 95 °C durant 10 minuts i sonicant, en el tampó de lisi [6 M de clorur de guanidina, 10 mM de clorhidrat de tris(2-carboxietil)fosfina, 10 mM de cloroacetamida i 100 mM de pellets de neurones congelades de tris-Lise en HCl]. En un Bioruptor (Diagenode) durant 10 minuts (30 segons de pols / 30 segons de pausa). La mostra es va diluir 1:10 en 20 mM de tris-HCl (pH 8,0), es va barrejar amb 300 ng de tripsina or (Promega) i es va incubar durant la nit a 37 °C per aconseguir una digestió completa. El segon dia, la mostra es va centrifugar a 20.000 g durant 20 minuts. El sobrenedant es va diluir amb àcid fòrmic al 0,1% i la solució es va dessalar amb StageTips casolans. La mostra es va assecar en un instrument SpeedVac (concentrador Eppendorf plus 5305) a 45 °C i, a continuació, el pèptid es va suspendre en àcid fòrmic al 0,1%. Totes les mostres van ser preparades simultàniament per la mateixa persona. Per analitzar mostres d'astròcits, es van marcar 4 μg de pèptids dessalats amb una etiqueta de massa en tàndem (TMT10plex, número de catàleg 90110, Thermo Fisher Scientific) amb una proporció de pèptid a reactiu TMT d'1:20. Per al marcatge TMT, es van resuspendre 0,8 mg de reactiu TMT en 70 μl d'ACN anhidre i el pèptid assecat es va reconstituir en 9 μl de TEAB 0,1 M (bicarbonat de trietilamoni), al qual es van afegir 7 μl de reactiu TMT en ACN. La concentració va ser del 43,75%. Després de 60 minuts d'incubació, la reacció es va aturar amb 2 μl d'hidroxilamina al 5%. Els pèptids marcats es van recollir, es van assecar, es van resuspendre en 200 μl d'àcid fòrmic (FA) al 0,1%, es van dividir en dos i després es van dessalar mitjançant StageTips fabricats per ells mateixos. Utilitzant un cromatògraf líquid d'ultra alt rendiment UltiMate 3000 (cromatògraf líquid d'ultra alt rendiment UltiMate 3000), una de les dues meitats es va fraccionar en una columna cromatogràfica Acquity d'1 mm x 150 mm plena de partícules de C18 de 130 Å1,7 μm (Waters, número de catàleg SKU: 186006935). Thermo Fisher Scientific). Separar els pèptids a un cabal de 30 μl/min, separar de tampó B de l'1% al 50% durant 85 minuts amb un gradient gradual de 96 minuts, de tampó B del 50% al 95% durant 3 minuts i després 8 minuts per a tampó B del 95%; El tampó A és un 5% d'ACN i 10 mM de bicarbonat d'amoni (ABC), i el tampó B és un 80% d'ACN i 10 mM d'ABC. Recolliu les fraccions cada 3 minuts i combineu-les en dos grups (1 + 17, 2 + 18, etc.) i assequeu-les en una centrífuga al buit.
Anàlisi LC-MS/MS. Per a l'espectrometria de masses, els pèptids (número r119.aq) es van separar en una columna analítica PicoFrit de 25 cm i 75 μm de diàmetre interior (lent objectiu nova, número de peça PF7508250) equipada amb un medi ReproSil-Pur 120 C18-AQ d'1,9 μm (Dr. Maisch, mat), utilitzant EASY-nLC 1200 (Thermo Fisher Scientific, Alemanya). La columna es va mantenir a 50 °C. Els tampons A i B són àcid fòrmic al 0,1% en aigua i àcid fòrmic al 0,1% en ACN al 80%, respectivament. Els pèptids es van separar del tampó B del 6% al 31% durant 65 minuts i del tampó B del 31% al 50% durant 5 minuts amb un gradient de 200 nl/min. Els pèptids eluïts es van analitzar en un espectròmetre de masses Orbitrap Fusion (Thermo Fisher Scientific). La mesura m/z del precursor peptídic es realitza amb una resolució de 120.000 en el rang de 350 a 1500 m/z. Utilitzant una energia de col·lisió normalitzada del 27%, es selecciona el precursor més fort amb un estat de càrrega de 2 a 6 per a l'escissió per dissociació de la trampa de C d'alta energia (HCD). El temps de cicle s'estableix en 1 s. El valor m/z del fragment de pèptid es va mesurar a la trampa d'ions utilitzant la diana AGC més petita de 5×104 i el temps màxim d'injecció de 86 ms. Després de la fragmentació, el precursor es va col·locar a la llista d'exclusió dinàmica durant 45 s. Els pèptids marcats amb TMT es van separar en una columna Acclaim PepMap de 50 cm i 75 μm (Thermo Fisher Scientific, número de catàleg 164942), i els espectres de migració es van analitzar en un espectròmetre de masses Orbitrap Lumos Tribrid (Thermo Fisher Scientific) equipat amb un equip d'ions de forma d'ona asimètrica d'alt camp (FAIMS) (Thermo Fisher Scientific) que funciona a dos voltatges de compensació de −50 i −70 V. L'MS3 seleccionat en funció del precursor de sincronització s'utilitza per a la mesura del senyal iònic de l'informe TMT. La separació de pèptids es va dur a terme en EASY-nLC 1200, utilitzant una elució de gradient lineal del 90%, amb una concentració de tampó del 6% al 31%; el tampó A era 0,1% de FA i el tampó B era 0,1% de FA i 80% d'ACN. La columna analítica funciona a 50 °C. Utilitzeu FreeStyle (versió 1.6, Thermo Fisher Scientific) per dividir el fitxer original segons el voltatge de compensació FAIMS.
Identificació i quantificació de proteïnes. Mitjançant el motor de cerca integrat d'Andromeda, les dades originals es van analitzar amb MaxQuant versió 1.5.2.8 (https://maxquant.org/). A més de les seqüències de la recombinasa Cre i YFP obtingudes d'Aequorea victoria, es van cercar espectres de fragments de pèptids per la seqüència canònica i la seqüència d'isoformes del proteoma de referència del ratolí (ID del proteoma UP000000589, descarregat d'UniProt el maig de 2017). L'oxidació de la metionina i l'acetilació N-terminal de la proteïna es van establir com a modificacions variables; la metilació de la cisteïna carbamoil es va establir com a modificacions fixes. Els paràmetres de digestió s'estableixen en "especificitat" i "tripsina/P". El nombre mínim de pèptids i pèptids d'afaitar utilitzats per a la identificació de proteïnes és 1; el nombre mínim de pèptids únics és 0. En les condicions de coincidència del mapa de pèptids, la taxa d'identificació de proteïnes va ser de 0,01. L'opció "Segon pèptid" està habilitada. Utilitzeu l'opció "coincidència entre execucions" per transferir identificacions reeixides entre diferents fitxers originals. Utilitzeu el recompte mínim de ràtio LFQ d'1 per a la quantificació sense etiquetatge (LFQ) (60). La intensitat LFQ es filtra per almenys dos valors vàlids en almenys un grup de genotips a cada punt de temps, i s'extrapola d'una distribució normal amb una amplada de 0,0,3 i un desplaçament cap avall d'1,8. Utilitzeu la plataforma informàtica Perseus (https://maxquant.net/perseus/) i R (https://r-project.org/) per analitzar els resultats LFQ. Es va utilitzar una prova t moderada bidireccional del paquet de programari limma per a l'anàlisi d'expressió diferencial (61). L'anàlisi exploratòria de dades es realitza mitjançant ggplot, FactoMineR, factoextra, GGally i pheatmap. Les dades proteòmiques basades en TMT es van analitzar mitjançant MaxQuant versió 1.6.10.43. Cerca dades proteòmiques en brut de la base de dades de proteòmica humana d'UniProt, que es va descarregar el setembre de 2018. L'anàlisi inclou el factor de correcció de la puresa isotòpica proporcionat pel fabricant. Utilitza limma a R per a l'anàlisi d'expressió diferencial. Les dades originals, els resultats de la cerca a la base de dades i el flux de treball i els resultats de l'anàlisi de dades s'emmagatzemen a l'aliança ProteomeXchange a través del repositori de socis PRIDE amb l'identificador del conjunt de dades PXD019690.
Les anotacions funcionals enriqueixen l'anàlisi. L'eina Ingenuity Pathway Analysis (QIAGEN) es va utilitzar per determinar la riquesa dels termes d'anotació funcional del conjunt de dades a les 8 setmanes (Figura 1). En resum, la llista quantitativa de proteïnes obtinguda de l'anàlisi de dades LC-MS/MS (espectrometria de masses en tàndem) s'utilitza amb els següents criteris de filtre: Mus musculus es selecciona com a espècie i fons, i la categoria mostra que el valor P ajustat per Benjamini per a un enriquiment de 0,05 o inferior es considera significatiu. Per a aquest gràfic, es mostren les cinc categories d'excés principals de cada clúster basades en el valor P ajustat. Mitjançant la prova t múltiple, utilitzant el programa d'impuls lineal de dues etapes de Benjamini, Krieger i Yekutieli (Q = 5%), es realitza una anàlisi d'expressió de proteïnes al llarg del temps sobre els candidats importants identificats a cada categoria i cada fila s'analitza per separat. No cal adoptar una SD consistent.
Per tal de comparar els resultats d'aquest estudi amb les bases de dades publicades i generar un diagrama de Venn a la Figura 1, vam combinar la llista quantitativa de proteïnes amb les anotacions de MitoCarta 2.0 (24). Utilitzeu l'eina en línia Draw Venn Diagram (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/) per generar el diagrama.
Per obtenir informació detallada sobre els procediments estadístics utilitzats per a l'anàlisi proteòmica, consulteu la secció corresponent de Materials i mètodes. Per a tots els altres experiments, podeu trobar informació detallada a la llegenda corresponent. Si no s'especifica el contrari, totes les dades s'expressen com a mitjana ± SEM, i totes les anàlisis estadístiques es van realitzar amb el programari GraphPad Prism 8.1.2.
Per a materials suplementaris per a aquest article, consulteu http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/35/eaba8271/DC1
Aquest és un article d'accés obert distribuït sota els termes de la Llicència Creative Commons Reconeixement-NoComercial, que permet l'ús, la distribució i la reproducció en qualsevol mitjà, sempre que l'ús final no sigui amb finalitats comercials i la premissa sigui que l'obra original sigui correcta. Referència.
Nota: Només us demanem que proporcioneu la vostra adreça electrònica perquè la persona que recomaneu a la pàgina sàpiga que voleu que vegi el correu electrònic i que no és correu brossa. No capturarem cap adreça electrònica.
Aquesta pregunta s'utilitza per comprovar si sou un visitant i evitar l'enviament automàtic de correu brossa.
Per E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson
L'anàlisi proteòmica de neurones disfuncionals va revelar que s'activen programes metabòlics per contrarestar la neurodegeneració.
Per E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson
L'anàlisi proteòmica de neurones disfuncionals va revelar que s'activen programes metabòlics per contrarestar la neurodegeneració.
©2020 Associació Americana per a l'Avenç de la Ciència. tots els drets reservats. AAAS és soci de HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef i COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.