L'article forma part del tema de recerca "Tecnologies avançades de biorremediació i processos de reciclatge de compostos orgànics sintètics (SOC)". Veure tots els 14 articles
Els hidrocarburs aromàtics policíclics (HAP) de baix pes molecular com el naftalè i els naftalens substituïts (metilnaftalè, àcid naftoic, 1-naftil-N-metilcarbamat, etc.) s'utilitzen àmpliament en diverses indústries i són genotòxics, mutagènics i/o carcinògens per als organismes. Aquests compostos orgànics sintètics (COS) o xenobiòtics es consideren contaminants prioritaris i representen una greu amenaça per al medi ambient global i la salut pública. La intensitat de les activitats humanes (per exemple, la gasificació del carbó, el refinament del petroli, les emissions dels vehicles i les aplicacions agrícoles) determina la concentració, el destí i el transport d'aquests compostos omnipresents i persistents. A més dels mètodes de tractament/eliminació físics i químics, les tecnologies verdes i respectuoses amb el medi ambient com la biorremediació, que utilitzen microorganismes capaços de degradar completament els COP o convertir-los en subproductes no tòxics, han sorgit com una alternativa segura, rendible i prometedora. Diverses espècies bacterianes pertanyents als fílums Proteobacteria (Pseudomonas, Pseudomonas, Comamonas, Burkholderia i Neosphingobacterium), Firmicutes (Bacillus i Paenibacillus) i Actinobacteria (Rhodococcus i Arthrobacter) a la microbiota del sòl han demostrat la capacitat de degradar diversos compostos orgànics. Els estudis metabòlics, la genòmica i l'anàlisi metagenòmica ens ajuden a comprendre la complexitat i diversitat catabòlica presents en aquestes formes de vida simples, que es poden aplicar encara més a una biodegradació eficient. L'existència a llarg termini dels HAP ha donat lloc a l'aparició de nous fenotips de degradació mitjançant la transferència horitzontal de gens utilitzant elements genètics com ara plasmidis, transposons, bacteriòfags, illes genòmiques i elements conjugatius integratius. La biologia de sistemes i l'enginyeria genètica d'aïllats específics o comunitats model (consorcis) poden permetre una biorremediació completa, ràpida i eficient d'aquests HAP mitjançant efectes sinèrgics. En aquesta revisió, ens centrem en les diferents vies metabòliques i la diversitat, la composició i diversitat genètiques, i les respostes/adaptacions cel·lulars del naftalè i dels bacteris que degraden el naftalè substituït. Això proporcionarà informació ecològica per a l'aplicació al camp i l'optimització de soques per a una biorremediació eficient.
El ràpid desenvolupament de les indústries (petroquímiques, agricultura, productes farmacèutics, tints tèxtils, cosmètics, etc.) ha contribuït a la prosperitat econòmica mundial i a la millora del nivell de vida. Aquest desenvolupament exponencial ha donat lloc a la producció d'un gran nombre de compostos orgànics sintètics (COS), que s'utilitzen per fabricar diversos productes. Aquests compostos estranys o COS inclouen hidrocarburs aromàtics policíclics (HAP), pesticides, herbicides, plastificants, colorants, productes farmacèutics, organofosfats, retardants de flama, dissolvents orgànics volàtils, etc. S'emeten a l'atmosfera, als ecosistemes aquàtics i terrestres, on tenen impactes multidimensionals, causant efectes perjudicials sobre diverses bioformes mitjançant l'alteració de les propietats fisicoquímiques i l'estructura de la comunitat (Petrie et al., 2015; Bernhardt et al., 2017; Sarkar et al., 2020). Molts contaminants aromàtics tenen impactes forts i destructius en molts ecosistemes intactes/zones calentes de biodiversitat (per exemple, esculls de corall, capes de gel àrtiques/antàrtiques, llacs d'alta muntanya, sediments d'aigües profundes, etc.) (Jones 2010; Beyer et al. 2020; Nordborg et al. 2020). Estudis geomicrobiològics recents han demostrat que la deposició de matèria orgànica sintètica (per exemple, contaminants aromàtics) i els seus derivats a les superfícies d'estructures artificials (entorn construït) (per exemple, llocs del patrimoni cultural i monuments fets de granit, pedra, fusta i metall) accelera la seva degradació (Gadd 2017; Liu et al. 2018). Les activitats humanes poden intensificar i empitjorar la degradació biològica dels monuments i edificis a través de la contaminació de l'aire i el canvi climàtic (Liu et al. 2020). Aquests contaminants orgànics reaccionen amb el vapor d'aigua de l'atmosfera i s'assenten sobre l'estructura, causant la degradació física i química del material. La biodegradació és àmpliament reconeguda com a canvis indesitjables en l'aspecte i les propietats dels materials causats per organismes vius que afecten la seva preservació (Pochon i Jaton, 1967). L'acció microbiana addicional (metabolisme) d'aquests compostos pot reduir la integritat estructural, l'eficàcia de la conservació i el valor cultural (Gadd, 2017; Liu et al., 2018). D'altra banda, en alguns casos, s'ha descobert que l'adaptació i la resposta microbiana a aquestes estructures són beneficioses, ja que formen biofilms i altres crostes protectores que redueixen la taxa de descomposició (Martino, 2016). Per tant, el desenvolupament d'estratègies de conservació sostenibles a llarg termini i efectives per a monuments de pedra, metall i fusta requereix una comprensió profunda dels processos clau implicats en aquest procés. En comparació amb els processos naturals (processos geològics, incendis forestals, erupcions volcàniques, reaccions de plantes i bacteris), les activitats humanes provoquen l'alliberament de grans volums d'hidrocarburs aromàtics policíclics (HAP) i altre carboni orgànic (CO) als ecosistemes. Molts HAP utilitzats en l'agricultura (insecticides i pesticides com el DDT, l'atrazina, el carbaril, el pentaclorofenol, etc.), la indústria (petroli cru, fangs/residus de petroli, plàstics derivats del petroli, PCB, plastificants, detergents, desinfectants, fumigants, fragàncies i conservants), productes d'higiene personal (protectors solars, desinfectants, repel·lents d'insectes i mescs policíclics) i municions (explosius com el 2,4,6-TNT) són possibles xenobiòtics que poden afectar la salut planetària (Srogi, 2007; Vamsee-Krishna i Phale, 2008; Petrie et al., 2015). Aquesta llista es pot ampliar per incloure compostos derivats del petroli (fuel-olis, lubricants, asfaltens), bioplàstics d'alt pes molecular i líquids iònics (Amde et al., 2015). La Taula 1 enumera diversos contaminants aromàtics i les seves aplicacions en diverses indústries. En els darrers anys, les emissions antropogèniques de compostos orgànics volàtils, així com de diòxid de carboni i altres gasos d'efecte hivernacle, han començat a augmentar (Dvorak et al., 2017). Tanmateix, els impactes antropogènics superen significativament els naturals. A més, hem descobert que diversos compostos orgànics volàtils (SOC) persisteixen en molts entorns ambientals i s'han identificat com a contaminants emergents amb efectes adversos sobre els biomes (Figura 1). Les agències ambientals com l'Agència de Protecció Ambiental dels Estats Units (USEPA) han inclòs molts d'aquests contaminants a la seva llista de prioritats a causa de les seves propietats citotòxiques, genotòxiques, mutagèniques i cancerígenes. Per tant, calen regulacions estrictes d'eliminació i estratègies efectives per al tractament/eliminació de residus dels ecosistemes contaminats. Diversos mètodes de tractament físic i químic com la piròlisi, el tractament tèrmic oxidatiu, l'aireació de l'aire, l'abocament, la incineració, etc. són ineficaços i costosos, i generen subproductes corrosius, tòxics i difícils de tractar. Amb la creixent consciència ambiental global, els microorganismes capaços de degradar aquests contaminants i els seus derivats (com ara halogenats, nitro, alquil i/o metil) estan atraient una atenció creixent (Fennell et al., 2004; Haritash i Kaushik, 2009; Phale et al., 2020; Sarkar et al., 2020; Schwanemann et al., 2020). L'ús d'aquests microorganismes candidats autòctons sols o en cultius mixtos (colònies) per a l'eliminació de contaminants aromàtics té avantatges en termes de seguretat ambiental, cost, eficiència, eficàcia i sostenibilitat. Els investigadors també estan explorant la integració de processos microbians amb mètodes redox electroquímics, és a dir, sistemes bioelectroquímics (BES), com a tecnologia prometedora per al tractament/eliminació de contaminants (Huang et al., 2011). La tecnologia BES ha atret una atenció creixent a causa de la seva alta eficiència, baix cost, seguretat ambiental, funcionament a temperatura ambient, materials biocompatibles i la capacitat de recuperar subproductes valuosos (per exemple, electricitat, combustible i productes químics) (Pant et al., 2012; Nazari et al., 2020). L'arribada de la seqüenciació del genoma d'alt rendiment i les eines/mètodes òmiques ha proporcionat una gran quantitat d'informació nova sobre la regulació genètica, la proteòmica i la fluxòmica de les reaccions de diversos microorganismes degradants. La combinació d'aquestes eines amb la biologia de sistemes ha millorat encara més la nostra comprensió de la selecció i l'ajustament de les vies catabòliques diana en els microorganismes (és a dir, el disseny metabòlic) per aconseguir una biodegradació eficient i eficaç. Per dissenyar estratègies de biorremediació efectives utilitzant microorganismes candidats adequats, necessitem comprendre el potencial bioquímic, la diversitat metabòlica, la composició genètica i l'ecologia (autoecologia/sinecologia) dels microorganismes.
Fig. 1. Fonts i vies dels HAP de baix pes molecular a través de diversos entorns ambientals i diversos factors que afecten la biota. Les línies discontínues representen les interaccions entre els elements de l'ecosistema.
En aquesta revisió, hem intentat resumir les dades sobre la degradació d'HAP simples com el naftalè i els naftalens substituïts per diversos aïllats bacterians que cobreixen les vies metabòliques i la diversitat, els enzims implicats en la degradació, la composició/contingut i la diversitat gènica, les respostes cel·lulars i diversos aspectes de la biorremediació. Comprendre els nivells bioquímics i moleculars ajudarà a identificar soques hostes adequades i la seva posterior enginyeria genètica per a una biorremediació eficaç d'aquests contaminants prioritaris. Això ajudarà a desenvolupar estratègies per a l'establiment de consorcis bacterians específics del lloc per a una biorremediació eficaç.
La presència d'un gran nombre de compostos aromàtics tòxics i perillosos (que satisfan la regla de Hückel 4n + 2π electrons, n = 1, 2, 3,...) representa una greu amenaça per a diversos medis ambientals com l'aire, el sòl, els sediments i les aigües superficials i subterrànies (Puglisi et al., 2007). Aquests compostos tenen anells benzènics individuals (monocíclics) o múltiples anells benzènics (policíclics) disposats en forma lineal, angular o de clúster i presenten estabilitat (estabilitat/inestabilitat) en el medi ambient a causa de l'alta energia de ressonància negativa i la inertícia (inertia), que es pot explicar per la seva hidrofobicitat i estat reduït. Quan l'anell aromàtic es substitueix per grups metil (-CH3), carboxil (-COOH), hidroxil (-OH) o sulfonat (-HSO3), es torna més estable, té una afinitat més forta per les macromolècules i és bioacumulable en sistemes biològics (Seo et al., 2009; Phale et al., 2020). Alguns hidrocarburs aromàtics policíclics de baix pes molecular (LMWAHs), com el naftalè i els seus derivats [metilnaftalè, àcid naftoic, naftalensulfonat i 1-naftil N-metilcarbamat (carbaril)], han estat inclosos a la llista de contaminants orgànics prioritaris per l'Agència de Protecció Ambiental dels Estats Units com a genotòxics, mutagènics i/o cancerígens (Cerniglia, 1984). L'alliberament d'aquesta classe de NM-HAP al medi ambient pot provocar la bioacumulació d'aquests compostos a tots els nivells de la cadena alimentària, afectant així la salut dels ecosistemes (Binkova et al., 2000; Srogi, 2007; Quinn et al., 2009).
Les fonts i les vies dels HAP a la biota són principalment a través de la migració i les interaccions entre diferents components de l'ecosistema, com ara el sòl, les aigües subterrànies, les aigües superficials, els cultius i l'atmosfera (Arey i Atkinson, 2003). La figura 1 mostra les interaccions i la distribució de diferents HAP de baix pes molecular en els ecosistemes i les seves vies cap a l'exposició a la biota/humà. Els HAP es dipositen a les superfícies com a resultat de la contaminació de l'aire i a través de la migració (deriva) de les emissions dels vehicles, els gasos d'escapament industrials (gasificació del carbó, combustió i producció de coc) i la seva deposició. Les activitats industrials com la fabricació de tèxtils sintètics, tints i pintures; la conservació de la fusta; el processament del cautxú; les activitats de fabricació de ciment; la producció de pesticides; i les aplicacions agrícoles són fonts importants d'HAP en els sistemes terrestres i aquàtics (Bamforth i Singleton, 2005; Wick et al., 2011). Els estudis han demostrat que els sòls de les zones suburbanes i urbanes, a prop de les autopistes i de les grans ciutats són més susceptibles als hidrocarburs aromàtics policíclics (HAP) a causa de les emissions de les centrals elèctriques, la calefacció residencial, les càrregues de trànsit aeri i rodat i les activitats de construcció (Suman et al., 2016). (2008) va mostrar que els HAP al sòl a prop de les carreteres de Nova Orleans, Louisiana, EUA, eren de fins a 7189 μg/kg, mentre que en espais oberts, només eren de 2404 μg/kg. De la mateixa manera, s'han reportat nivells d'HAP de fins a 300 μg/kg en zones properes a llocs de gasificació de carbó en diverses ciutats dels EUA (Kanaly i Harayama, 2000; Bamforth i Singleton, 2005). S'ha informat que sòls de diverses ciutats índies com Delhi (Sharma et al., 2008), Agra (Dubey et al., 2014), Mumbai (Kulkarni i Venkataraman, 2000) i Visakhapatnam (Kulkarni et al., 2014) contenen altes concentracions d'HAP. Els compostos aromàtics s'adsorbeixen més fàcilment a les partícules del sòl, la matèria orgànica i els minerals argilosos, convertint-se així en importants embornals de carboni en els ecosistemes (Srogi, 2007; Peng et al., 2008). Les principals fonts d'HAP en els ecosistemes aquàtics són la precipitació (precipitació humida/seca i vapor d'aigua), l'escolament urbà, l'abocament d'aigües residuals, la recàrrega d'aigües subterrànies, etc. (Srogi, 2007). S'estima que al voltant del 80% dels HAP en els ecosistemes marins provenen de la precipitació, la sedimentació i l'abocament de residus (Motelay-Massei et al., 2006; Srogi, 2007). Concentracions més altes d'HAP en aigües superficials o lixiviats d'abocadors de residus sòlids acaben filtrant-se a les aigües subterrànies, cosa que representa una amenaça important per a la salut pública, ja que més del 70% de la població del sud i sud-est d'Àsia beu aigües subterrànies (Duttagupta et al., 2019). Un estudi recent de Duttagupta et al. (2020) d'anàlisis de rius (32) i aigües subterrànies (235) de Bengala Occidental, Índia, va trobar que aproximadament el 53% dels residents urbans i el 44% dels residents rurals (un total de 20 milions de residents) poden estar exposats al naftalè (4,9–10,6 μg/L) i els seus derivats. Els patrons d'ús diferencial del sòl i l'augment de l'extracció d'aigües subterrànies es consideren els principals factors que controlen el transport vertical (advecció) d'HAP de baix pes molecular al subsòl. S'ha descobert que l'escolament agrícola, els abocaments d'aigües residuals municipals i industrials i els abocaments de residus sòlids/escombraries es veuen afectats pels HAP a les conques fluvials i als sediments subterranis. Les precipitacions atmosfèriques agreugen encara més la contaminació per HAP. S'han reportat altes concentracions de HAP i els seus derivats alquils (51 en total) en rius/conques hidrogràfiques de tot el món, com ara el riu Fraser, el riu Louan, el riu Denso, el riu Missouri, el riu Anacostia, el riu Ebre i el riu Delaware (Yunker et al., 2002; Motelay-Massei et al., 2006; Li et al., 2010; Amoako et al., 2011; Kim et al., 2018). En els sediments de la conca del riu Ganges, es va trobar que el naftalè i el fenantrè eren els més significatius (detectats en el 70% de les mostres) (Duttagupta et al., 2019). A més, estudis han demostrat que la cloració de l'aigua potable pot conduir a la formació de HAP oxigenats i clorats més tòxics (Manoli i Samara, 1999). Els HAP s'acumulen en cereals, fruites i verdures com a resultat de l'absorció per part de les plantes de sòls contaminats, aigües subterrànies i precipitacions (Fismes et al., 2002). Molts organismes aquàtics com ara peixos, musclos, cloïsses i gambes estan contaminats amb HAP a través del consum d'aliments i aigua de mar contaminats, així com a través dels teixits i la pell (Mackay i Fraser, 2000). Els mètodes de cocció/processament com ara rostir, rostir, fumar, fregir, assecar, coure al forn i cuinar amb carbó vegetal també poden conduir a quantitats significatives d'HAP en els aliments. Això depèn en gran mesura de l'elecció del material de fumar, el contingut d'hidrocarburs fenòlics/aromàtics, el procediment de cocció, el tipus d'escalfador, el contingut d'humitat, el subministrament d'oxigen i la temperatura de combustió (Guillén et al., 2000; Gomes et al., 2013). També s'han detectat hidrocarburs aromàtics policíclics (HAP) a la llet en concentracions variables (0,75–2,1 mg/L) (Girelli et al., 2014). L'acumulació d'aquests HAP en els aliments també depèn de les propietats fisicoquímiques dels aliments, mentre que els seus efectes tòxics estan relacionats amb les funcions fisiològiques, l'activitat metabòlica, l'absorció, la distribució i la distribució corporal (Mechini et al., 2011).
La toxicitat i els efectes nocius dels hidrocarburs aromàtics policíclics (HAP) són coneguts des de fa molt de temps (Cherniglia, 1984). Els hidrocarburs aromàtics policíclics de baix pes molecular (HAP-LMW) (de dos a tres anells) es poden unir covalentment a diverses macromolècules com l'ADN, l'ARN i les proteïnes i són cancerígens (Santarelli et al., 2008). A causa de la seva naturalesa hidrofòbica, estan separats per membranes lipídiques. En humans, les monooxigenases del citocrom P450 oxiden els HAP a epòxids, alguns dels quals són altament reactius (per exemple, l'epòxid de bediol) i poden conduir a la transformació de cèl·lules normals en malignes (Marston et al., 2001). A més, els productes de transformació dels HAP com les quinones, els fenols, els epòxids, els diols, etc. són més tòxics que els compostos originals. Alguns HAP i els seus intermediaris metabòlics poden afectar les hormones i diversos enzims del metabolisme, afectant així negativament el creixement, el sistema nerviós central, els sistemes reproductor i immunitari (Swetha i Phale, 2005; Vamsee-Krishna et al., 2006; Oostingh et al., 2008). S'ha informat que l'exposició a curt termini a HAP de baix pes molecular causa alteració de la funció pulmonar i trombosi en asmàtics i augmenta el risc de càncers de pell, pulmó, bufeta i gastrointestinals (Olsson et al., 2010; Diggs et al., 2011). Estudis en animals també han demostrat que l'exposició a HAP pot tenir efectes adversos sobre la funció i el desenvolupament reproductius i pot causar cataractes, danys renals i hepàtics, i icterícia. S'ha demostrat que diversos productes de biotransformació d'HAP, com ara diols, epòxids, quinones i radicals lliures (cations), formen adductes d'ADN. S'ha demostrat que els adductes estables alteren la maquinària de replicació de l'ADN, mentre que els adductes inestables poden despurinar l'ADN (principalment a adenina i de vegades a guanina); ambdós poden generar errors que condueixen a mutacions (Schweigert et al. 2001). A més, les quinones (benzo-/pan-) poden generar espècies reactives d'oxigen (ROS), causant danys fatals a l'ADN i altres macromolècules, afectant així la funció/viabilitat dels teixits (Ewa i Danuta 2017). S'ha informat que l'exposició crònica a baixes concentracions de pirè, bifenil i naftalè causa càncer en animals d'experimentació (Diggs et al. 2012). A causa de la seva toxicitat letal, la neteja/eliminació d'aquests HAP dels llocs afectats/contaminats és una prioritat.
S'han utilitzat diversos mètodes físics i químics per eliminar els HAP de llocs/entorns contaminats. Processos com la incineració, la descloració, l'oxidació UV, la fixació i l'extracció amb dissolvents presenten molts desavantatges, com ara la formació de subproductes tòxics, la complexitat del procés, problemes de seguretat i regulació, baixa eficiència i alt cost. Tanmateix, la biodegradació microbiana (anomenada biorremediació) és un enfocament alternatiu prometedor que implica l'ús de microorganismes en forma de cultius purs o colònies. En comparació amb els mètodes físics i químics, aquest procés és respectuós amb el medi ambient, no invasiu, rendible i sostenible. La biorremediació es pot dur a terme al lloc afectat (in situ) o en un lloc especialment preparat (ex situ) i, per tant, es considera un mètode de remediació més sostenible que els mètodes físics i químics tradicionals (Juhasz i Naidu, 2000; Andreoni i Gianfreda, 2007; Megharaj et al., 2011; Phale et al., 2020; Sarkar et al., 2020).
Comprendre els passos metabòlics microbians implicats en la degradació dels contaminants aromàtics té enormes implicacions científiques i econòmiques per a la sostenibilitat ecològica i ambiental. S'estima que 2,1 × 1018 grams de carboni (C) s'emmagatzemen en sediments i compostos orgànics (és a dir, petroli, gas natural i carbó, és a dir, combustibles fòssils) a tot el món, cosa que contribueix significativament al cicle global del carboni. Tanmateix, la ràpida industrialització, l'extracció de combustibles fòssils i les activitats humanes estan esgotant aquests reservoris de carboni litosfèric, alliberant uns 5,5 × 1015 g de carboni orgànic (com a contaminants) a l'atmosfera anualment (Gonzalez-Gaya et al., 2019). La major part d'aquest carboni orgànic entra als ecosistemes terrestres i marins a través de la sedimentació, el transport i l'escolament. A més, els nous contaminants sintètics derivats dels combustibles fòssils, com ara els plàstics, els plastificants i els estabilitzadors de plàstic (ftalats i els seus isòmers), contaminen greument els ecosistemes marins, del sòl i aquàtics i la seva biota, agreujant així els riscos climàtics globals. Diversos tipus de microplàstics, nanoplàstics, fragments de plàstic i els seus productes monòmers tòxics derivats del tereftalat de polietilè (PET) s'han acumulat a l'oceà Pacífic entre Amèrica del Nord i el sud-est asiàtic, formant la "Gran Pegat d'Escombraries del Pacífic", perjudicant la vida marina (Newell et al., 2020). Estudis científics han demostrat que no és possible eliminar aquests contaminants/residus mitjançant cap mètode físic o químic. En aquest context, els microorganismes més útils són aquells capaços de metabolitzar oxidativament els contaminants en diòxid de carboni, energia química i altres subproductes no tòxics que finalment entren en altres processos del cicle de nutrients (H, O, N, S, P, Fe, etc.). Per tant, comprendre l'ecofisiologia microbiana de la mineralització de contaminants aromàtics i el seu control ambiental és crucial per avaluar el cicle microbià del carboni, el pressupost net de carboni i els riscos climàtics futurs. Donada la necessitat urgent d'eliminar aquests compostos del medi ambient, han sorgit diverses ecoindústries centrades en tecnologies netes. Alternativament, la valorització dels residus industrials/substàncies químiques residuals acumulades en els ecosistemes (és a dir, l'enfocament de residus a riquesa) es considera un dels pilars de l'economia circular i els objectius de desenvolupament sostenible (Close et al., 2012). Per tant, comprendre els aspectes metabòlics, enzimàtics i genètics d'aquests possibles candidats a la degradació és de màxima importància per a l'eliminació i la biorremediació efectives d'aquests contaminants aromàtics.
Entre els molts contaminants aromàtics, prestem especial atenció als HAP de baix pes molecular com el naftalè i els naftalens substituïts. Aquests compostos són components importants dels combustibles derivats del petroli, els tints tèxtils, els productes de consum, els pesticides (boles de naftalina i repel·lents d'insectes), els plastificants i els tanins i, per tant, estan molt estesos en molts ecosistemes (Preuss et al., 2003). Informes recents destaquen l'acumulació de concentracions de naftalè en sediments d'aqüífers, aigües subterrànies i sòls subterranis, zones vadoses i llits de rius, cosa que suggereix la seva bioacumulació en el medi ambient (Duttagupta et al., 2019, 2020). La Taula 2 resumeix les propietats fisicoquímiques, les aplicacions i els efectes sobre la salut del naftalè i els seus derivats. En comparació amb altres HAP d'alt pes molecular, el naftalè i els seus derivats són menys hidròfobs, més solubles en aigua i àmpliament distribuïts en els ecosistemes, per la qual cosa sovint s'utilitzen com a substrats model per estudiar el metabolisme, la genètica i la diversitat metabòlica dels HAP. Un gran nombre de microorganismes són capaços de metabolitzar el naftalè i els seus derivats, i hi ha informació completa disponible sobre les seves vies metabòliques, enzims i característiques reguladores (Mallick et al., 2011; Phale et al., 2019, 2020). A més, el naftalè i els seus derivats estan designats com a compostos prototip per a l'avaluació de la contaminació ambiental a causa de la seva alta abundància i biodisponibilitat. L'Agència de Protecció Ambiental dels Estats Units estima que els nivells mitjans de naftalè són de 5,19 μg per metre cúbic del fum de les cigarretes, principalment de la combustió incompleta, i de 7,8 a 46 μg del fum lateral, mentre que l'exposició a la creosota i el naftalè és de 100 a 10.000 vegades més alta (Preuss et al. 2003). S'ha descobert que el naftalè, en particular, té toxicitat respiratòria i carcinogenicitat específiques per espècie, regió i sexe. Basant-se en estudis amb animals, l'Agència Internacional per a la Recerca del Càncer (IARC) ha classificat el naftalè com a "possible carcinogen humà" (Grup 2B)1. L'exposició a naftalens substituïts, principalment per inhalació o administració parenteral (oral), causa lesions al teixit pulmonar i augmenta la incidència de tumors pulmonars en rates i ratolins (Programa Nacional de Toxicologia 2). Els efectes aguts inclouen nàusees, vòmits, dolor abdominal, diarrea, mal de cap, confusió, sudoració profusa, febre, taquicàrdia, etc. D'altra banda, s'ha informat que l'insecticida carbamat d'ampli espectre carbaril (1-naftil N-metilcarbamat) és tòxic per a invertebrats aquàtics, amfibis, abelles i humans, i s'ha demostrat que inhibeix l'acetilcolinesterasa causant paràlisi (Smulders et al., 2003; Bulen i Distel, 2011). Per tant, comprendre els mecanismes de degradació microbiana, regulació genètica, reaccions enzimàtiques i cel·lulars és crucial per desenvolupar estratègies de biorremediació en entorns contaminats.
Taula 2. Informació detallada sobre les propietats fisicoquímiques, els usos, els mètodes d'identificació i les malalties associades del naftalè i els seus derivats.
En nínxols contaminats, els contaminants aromàtics hidròfobs i lipòfils poden causar diversos efectes cel·lulars sobre el microbioma (comunitat) ambiental, com ara canvis en la fluïdesa de la membrana, la permeabilitat de la membrana, la inflor de la bicapa lipídica, la interrupció de la transferència d'energia (cadena de transport d'electrons/força motriu de protons) i l'activitat de les proteïnes associades a la membrana (Sikkema et al., 1995). A més, alguns intermediaris solubles com els catecols i les quinones generen espècies reactives d'oxigen (ROS) i formen adductes amb l'ADN i les proteïnes (Penning et al., 1999). Així, l'abundància d'aquests compostos en els ecosistemes exerceix una pressió selectiva sobre les comunitats microbianes per convertir-se en degradadors eficients a diversos nivells fisiològics, incloent-hi l'absorció/transport, la transformació intracel·lular, l'assimilació/utilització i la compartimentació.
Una cerca al Ribosomal Database Project-II (RDP-II) va revelar que es van aïllar un total de 926 espècies bacterianes de medis o cultius d'enriquiment contaminats amb naftalè o els seus derivats. El grup Proteobacteria va tenir el nombre més alt de representants (n = 755), seguit de Firmicutes (52), Bacteroidetes (43), Actinobacteria (39), Tenericutes (10) i bacteris no classificats (8) (Figura 2). Els representants de γ-Proteobacteria (Pseudomonadales i Xanthomonadales) van dominar tots els grups gramnegatius amb un alt contingut de G+C (54%), mentre que Clostridiales i Bacillales (30%) eren grups grampositius amb baix contingut de G+C. Es va informar que Pseudomonas (el nombre més alt, 338 espècies) era capaç de degradar el naftalè i els seus derivats metil en diversos ecosistemes contaminats (quitrà de carbó, petroli, cru, fangs, vessaments de petroli, aigües residuals, residus orgànics i abocadors), així com en ecosistemes intactes (sòl, rius, sediments i aigües subterrànies) (Figura 2). A més, estudis d'enriquiment i anàlisi metagenòmica d'algunes d'aquestes regions van revelar que les espècies de Legionella i Clostridium no cultivades poden tenir capacitat degradativa, cosa que indica la necessitat de cultivar aquests bacteris per estudiar noves vies i diversitat metabòlica.
Fig. 2. Diversitat taxonòmica i distribució ecològica de representants bacterians en ambients contaminats amb naftalè i derivats de naftalè.
Entre els diversos microorganismes que degraden hidrocarburs aromàtics, la majoria són capaços de degradar el naftalè com a única font de carboni i energia. La seqüència d'esdeveniments implicats en el metabolisme del naftalè s'ha descrit per a Pseudomonas sp. (soques: NCIB 9816-4, G7, AK-5, PMD-1 i CSV86), Pseudomonas stutzeri AN10, Pseudomonas fluorescens PC20 i altres soques (ND6 i AS1) (Mahajan et al., 1994; Resnick et al., 1996; Annweiler et al., 2000; Basu et al., 2003; Dennis i Zylstra, 2004; Sota et al., 2006; El metabolisme s'inicia mitjançant una dioxigenasa multicomponent [naftalè dioxigenasa (NDO), una dioxigenasa hidroxilant en anell] que catalitza l'oxidació d'un dels anells aromàtics del naftalè utilitzant oxigen molecular com a altre substrat, convertint el naftalè en cis-naftalendiol (Figura 3). El cis-dihidrodiol es converteix en 1,2-dihidroxinaftalè mitjançant una deshidrogenasa. A La dioxigenasa d'escissió d'anell, 1,2-dihidroxinaftalè dioxigenasa (12DHNDO), converteix l'1,2-dihidroxinaftalè en àcid 2-hidroxicromè-2-carboxílic. La isomerització enzimàtica cis-trans produeix trans-o-hidroxibencilidenpiruvat, que és escindit per la hidratasa aldolasa en aldehid salicílic i piruvat. El piruvat d'àcid orgànic va ser el primer compost C3 derivat de l'esquelet de carboni del naftalè i dirigit a la via central del carboni. A més, la salicilaldehid deshidrogenasa dependent de NAD+ converteix el salicilaldehid en àcid salicílic. El metabolisme en aquesta etapa s'anomena "via superior" de la degradació del naftalè. Aquesta via és molt comuna en la majoria dels bacteris que degraden el naftalè. Tanmateix, hi ha algunes excepcions; per exemple, en el termòfil Bacillus hamburgii 2, la degradació del naftalè és iniciada per la naftalè 2,3-dioxigenasa per formar 2,3-dihidroxinaftaleno (Annweiler et al., 2000).
Figura 3. Vies de degradació del naftalè, metilnaftalè, àcid naftoic i carbaril. Els números encerclats representen els enzims responsables de la conversió seqüencial del naftalè i els seus derivats en productes posteriors. 1 — naftalè dioxigenasa (NDO); 2, cis-dihidrodiol deshidrogenasa; 3, 1,2-dihidroxinaftalè dioxigenasa; 4, isomerasa de l'àcid 2-hidroxicromè-2-carboxílic; 5, trans-O-hidroxibencilidenpiruvat hidratasa aldolasa; 6, salicilaldehid deshidrogenasa; 7, salicilat 1-hidroxilasa; 8, catecol 2,3-dioxigenasa (C23DO); 9, 2-hidroximuconat semialdehid deshidrogenasa; 10, 2-oxopent-4-enoat hidratasa; 11, 4-hidroxi-2-oxopentanoat aldolasa; 12, acetaldehid deshidrogenasa; 13, catecol-1,2-dioxigenasa (C12DO); 14, muconat cicloisomerasa; 15, muconolactona delta-isomerasa; 16, β-cetoadipatenol·lactona hidrolasa; 17, β-cetoadipat succinil-CoA transferasa; 18, β-cetoadipat-CoA tiolasa; 19, succinil-CoA: acetil-CoA succiniltransferasa; 20, salicilat 5-hidroxilasa; 21 – gentisat 1,2-dioxigenasa (GDO); 22, maleilpiruvat isomerasa; 23, fumarilpiruvat hidrolasa; 24, metilnaftalè hidroxilasa (NDO); 25, hidroximetilnaftalè deshidrogenasa; 26, naftalaldehid deshidrogenasa; 27, àcid 3-formilsalicílic oxidasa; 28, hidroxiisoftalat descarboxilasa; 29, carbaril hidrolasa (CH); 30, 1-naftol-2-hidroxilasa.
Depenent de l'organisme i la seva composició genètica, l'àcid salicílic resultant es metabolitza encara més, ja sigui a través de la via del catecol utilitzant la salicilat 1-hidroxilasa (S1H) o a través de la via del gentisat utilitzant la salicilat 5-hidroxilasa (S5H) (Figura 3). Com que l'àcid salicílic és el principal intermediari en el metabolisme del naftalè (via superior), els passos des de l'àcid salicílic fins a l'intermediari TCA sovint es denominen via inferior, i els gens s'organitzen en un sol operó. És habitual veure que els gens de l'operó de la via superior (nah) i l'operó de la via inferior (sal) estan regulats per factors reguladors comuns; per exemple, el NahR i l'àcid salicílic actuen com a inductors, permetent que tots dos operons metabolitzin completament el naftalè (Phale et al., 2019, 2020).
A més, el catecol es divideix cíclicament en 2-hidroximuconat semialdehid a través de la via meta per la catecol 2,3-dioxigenasa (C23DO) (Yen et al., 1988) i s'hidrolitza encara més per la 2-hidroximuconat semialdehid hidrolasa per formar àcid 2-hidroxipent-2,4-dienoic. El 2-hidroxipent-2,4-dienoat es converteix llavors en piruvat i acetaldehid per una hidratasa (2-oxopent-4-enoat hidratasa) i una aldolasa (4-hidroxi-2-oxopentanoat aldolasa) i després entra a la via central del carboni (Figura 3). Alternativament, el catecol es divideix cíclicament en cis,cis-muconat a través de la via orto per la catecol 1,2-oxigenasa (C12DO). La muconat cicloisomerasa, la muconolactona isomerasa i la β-cetoadipat-nollactona hidrolasa converteixen el cis,cis-muconat en 3-oxoadipat, que entra a la via central del carboni a través del succinil-CoA i l'acetil-CoA (Nozaki et al., 1968) (Figura 3).
En la via del gentisat (2,5-dihidroxibenzoat), l'anell aromàtic és clivat per la gentisat 1,2-dioxigenasa (GDO) per formar maleilpiruvat. Aquest producte es pot hidrolitzar directament a piruvat i malat, o es pot isomeritzar per formar fumarilpiruvat, que després es pot hidrolitzar a piruvat i fumarat (Larkin i Day, 1986). L'elecció de la via alternativa s'ha observat tant en bacteris gramnegatius com grampositius a nivell bioquímic i genètic (Morawski et al., 1997; Whyte et al., 1997). Els bacteris gramnegatius (Pseudomonas) prefereixen utilitzar l'àcid salicílic, que és un inductor del metabolisme del naftalè, descarboxilant-lo a catecol mitjançant la salicilat 1-hidroxilasa (Gibson i Subramanian, 1984). D'altra banda, en bacteris grampositius (Rhodococcus), la salicilat 5-hidroxilasa converteix l'àcid salicílic en àcid gentísic, mentre que l'àcid salicílic no té cap efecte inductiu sobre la transcripció dels gens del naftalè (Grund et al., 1992) (Figura 3).
S'ha informat que espècies com ara Pseudomonas CSV86, Oceanobacterium NCE312, Marinhomonas naphthotrophicus, Sphingomonas paucimobilis 2322, Vibrio cyclotrophus, Pseudomonas fluorescens LP6a, Pseudomonas i espècies de Mycobacterium poden degradar el monometilnaftalè o el dimetilnaftalè (Dean-Raymond i Bartha, 1975; Cane i Williams, 1982; Mahajan et al., 1994; Dutta et al., 1998; Hedlund et al., 1999). Entre elles, la via de degradació de l'1-metilnaftalè i el 2-metilnaftalè de Pseudomonas sp. CSV86 s'ha estudiat clarament a nivell bioquímic i enzimàtic (Mahajan et al., 1994). L'1-metilnaftalè es metabolitza a través de dues vies. Primer, l'anell aromàtic s'hidroxila (l'anell no substituït del metilnaftalè) per formar cis-1,2-dihidroxi-1,2-dihidro-8-metilnaftalè, que s'oxida encara més a salicilat de metil i metilcatecol, i després entra a la via central del carboni després de l'escissió de l'anell (Figura 3). Aquesta via s'anomena "via de la font de carboni". En la segona "via de desintoxicació", el grup metil pot ser hidroxilat per NDO per formar 1-hidroximetilnaftalè, que s'oxida encara més a àcid 1-naftoic i s'excreta al medi de cultiu com a producte sense sortida. Els estudis han demostrat que la soca CSV86 no pot créixer en àcid 1- i 2-naftoic com a única font de carboni i energia, confirmant la seva via de desintoxicació (Mahajan et al., 1994; Basu et al., 2003). En el 2-metilnaftalè, el grup metil pateix hidroxilació per hidroxilasa per formar 2-hidroximetilnaftalè. A més, l'anell no substituït de l'anell de naftalè pateix hidroxilació per formar un dihidrodiol, que s'oxida a 4-hidroximetilcatecol en una sèrie de reaccions catalitzades per enzims i entra a la via central del carboni a través de la via d'escissió del metaanell. De manera similar, es va informar que S. paucimobilis 2322 utilitza NDO per hidroxilar 2-metilnaftalè, que s'oxida encara més per formar salicilat de metil i metilcatecol (Dutta et al., 1998).
Els àcids naftoics (substituïts/no substituïts) són subproductes de desintoxicació/biotransformació que es formen durant la degradació del metilnaftalè, el fenantrè i l'antracè i que s'alliberen al medi de cultiu gastat. S'ha informat que l'aïllat del sòl Stenotrophomonas maltophilia CSV89 és capaç de metabolitzar l'àcid 1-naftoic com a font de carboni (Phale et al., 1995). El metabolisme comença amb la dihidroxilació de l'anell aromàtic per formar 1,2-dihidroxi-8-carboxinaftalè. El diol resultant s'oxida a catecol a través del 2-hidroxi-3-carboxibencilidenpiruvat, l'àcid 3-formilsalicílic, l'àcid 2-hidroxiisoftàlic i l'àcid salicílic i entra a la via central del carboni a través de la via d'escissió del metaanell (Figura 3).
El carbaril és un pesticida de carbamat de naftil. Des de la Revolució Verda a l'Índia a la dècada de 1970, l'ús de fertilitzants i pesticides químics ha provocat un augment de les emissions d'hidrocarburs aromàtics policíclics (HAP) de fonts agrícoles no puntuals (Pingali, 2012; Duttagupta et al., 2020). S'estima que el 55% (85.722.000 hectàrees) del total de terres de cultiu a l'Índia es tracten amb pesticides químics. Durant els darrers cinc anys (2015-2020), el sector agrícola indi ha utilitzat una mitjana de 55.000 a 60.000 tones de pesticides anuals (Departament de Cooperatives i Benestar dels Agricultors, Ministeri d'Agricultura, Govern de l'Índia, agost de 2020). A les planes del Ganges del nord i del centre (els estats amb la població i la densitat de població més altes), l'ús de pesticides en els cultius està molt estès, amb predomini dels insecticides. El carbaril (1-naftil-N-metilcarbamat) és un insecticida carbamat d'ampli espectre, de moderadament a altament tòxic, que s'utilitza a l'agricultura índia a una dosi mitjana de 100-110 tones. Es ven habitualment amb el nom comercial Sevin i s'utilitza per controlar insectes (pugons, formigues de foc, puces, àcars, aranyes i moltes altres plagues de l'aire lliure) que afecten una varietat de cultius (blat de moro, soja, cotó, fruites i verdures). Alguns microorganismes com ara Pseudomonas (NCIB 12042, 12043, C4, C5, C6, C7, Pseudomonas putida XWY-1), Rhodococcus (NCIB 12038), Sphingobacterium spp. (CF06), Burkholderia (C3), Micrococcus i Arthrobacter també es poden utilitzar per controlar altres plagues. S'ha informat que RC100 pot degradar el carbaril (Larkin i Day, 1986; Chapalamadugu i Chaudhry, 1991; Hayatsu et al., 1999; Swetha i Phale, 2005; Trivedi et al., 2017). La via de degradació del carbaril s'ha estudiat àmpliament a nivells bioquímic, enzimàtic i genètic en aïllats del sòl de Pseudomonas sp. Soques C4, C5 i C6 (Swetha i Phale, 2005; Trivedi et al., 2016) (Fig. 3). La via metabòlica comença amb la hidròlisi de l'enllaç èster per la carbaril hidrolasa (CH4) per formar 1-naftol, metilamina i diòxid de carboni. L'1-naftol es converteix llavors en 1,2-dihidroxinaftalè mitjançant l'1-naftol hidroxilasa (1-NH), que es metabolitza encara més a través de la via central del carboni mitjançant salicilat i gentisat. S'ha informat que alguns bacteris que degraden el carbaril el metabolitzen a àcid salicílic mitjançant l'escissió de l'anell orto del catecol (Larkin i Day, 1986; Chapalamadugu i Chaudhry, 1991). Cal destacar que els bacteris que degraden el naftalè metabolitzen principalment l'àcid salicílic mitjançant el catecol, mentre que els bacteris que degraden el carbaril prefereixen metabolitzar l'àcid salicílic a través de la via del gentisat.
L'àcid naftalensulfònic/àcid disulfònic i els derivats de l'àcid naftilaminasulfònic es poden utilitzar com a intermediaris en la producció de colorants azoics, agents humectants, dispersants, etc. Tot i que aquests compostos tenen una baixa toxicitat per als humans, les avaluacions de citotoxicitat han demostrat que són letals per als peixos, les dàfnies i les algues (Greim et al., 1994). S'ha informat que els representants del gènere Pseudomonas (soques A3, C22) inicien el metabolisme mitjançant la doble hidroxilació de l'anell aromàtic que conté el grup àcid sulfònic per formar un dihidrodiol, que es converteix posteriorment en 1,2-dihidroxinaftalè mitjançant l'escissió espontània del grup sulfit (Brilon et al., 1981). L'1,2-dihidroxinaftalè resultant es catabolitza a través de la via clàssica del naftalè, és a dir, la via del catecol o del gentisat (Figura 4). S'ha demostrat que l'àcid aminonaftalensulfònic i l'àcid hidroxinaftalensulfònic poden ser completament degradats per consorcis bacterians mixtos amb vies catabòliques complementàries (Nortemann et al., 1986). S'ha demostrat que un membre del consorci desulfuritza l'àcid aminonaftalensulfònic o l'àcid hidroxinaftalensulfònic mitjançant 1,2-dioxigenació, mentre que l'aminosalicilat o l'hidroxisalicilat s'allibera al medi de cultiu com a metabòlit sense sortida i posteriorment és absorbit per altres membres del consorci. L'àcid naftalenisulfònic és relativament polar però poc biodegradable i, per tant, es pot metabolitzar a través de diferents vies. La primera dessulfuració es produeix durant la dihidroxilació regioselectiva de l'anell aromàtic i el grup d'àcid sulfònic; la segona dessulfuració es produeix durant la hidroxilació de l'àcid 5-sulfosalicílic per la 5-hidroxilasa de l'àcid salicílic per formar àcid gentísic, que entra a la via central del carboni (Brilon et al., 1981) (Figura 4). Els enzims responsables de la degradació del naftalè també són responsables del metabolisme del sulfonat de naftalè (Brilon et al., 1981; Keck et al., 2006).
Figura 4. Vies metabòliques per a la degradació del sulfonat de naftalè. Els números dins dels cercles representen els enzims responsables del metabolisme del sulfonat de naftil, similars/idèntics als enzims descrits a la FIG. 3.
Els HAP de baix pes molecular (HBPM) són reduïbles, hidròfobs i poc solubles, i per tant no són susceptibles a la degradació/descomposició natural. Tanmateix, els microorganismes aeròbics són capaços d'oxidar-los absorbint oxigen molecular (O2). Aquests enzims pertanyen principalment a la classe de les oxidoreductases i poden realitzar diverses reaccions com la hidroxilació de l'anell aromàtic (mono o dihidroxilació), la deshidrogenació i l'escissió de l'anell aromàtic. Els productes obtinguts d'aquestes reaccions es troben en un estat d'oxidació més alt i es metabolitzen més fàcilment a través de la via central del carboni (Phale et al., 2020). S'ha informat que els enzims de la via de degradació són induïbles. L'activitat d'aquests enzims és molt baixa o insignificant quan les cèl·lules es cultiven en fonts de carboni simples com la glucosa o els àcids orgànics. La Taula 3 resumeix els diversos enzims (oxigenases, hidrolases, deshidrogenases, oxidases, etc.) implicats en el metabolisme del naftalè i els seus derivats.
Taula 3. Característiques bioquímiques dels enzims responsables de la degradació del naftalè i els seus derivats.
Estudis de radioisòtops (18O2) han demostrat que la incorporació d'O2 molecular en anells aromàtics per oxigenases és el pas més important per activar una biodegradació posterior d'un compost (Hayaishi et al., 1955; Mason et al., 1955). La incorporació d'un àtom d'oxigen (O) de l'oxigen molecular (O2) al substrat s'inicia mitjançant monooxigenases endògenes o exògenes (també anomenades hidroxilases). Un altre àtom d'oxigen es redueix a aigua. Les monooxigenases exògenes redueixen la flavina amb NADH o NADPH, mentre que en les endomonooxigenases la flavina es redueix pel substrat. La posició d'hidroxilació resulta en diversitat en la formació del producte. Per exemple, la salicilat 1-hidroxilasa hidroxila l'àcid salicílic a la posició C1, formant catecol. D'altra banda, la salicilat 5-hidroxilasa multicomponent (que conté subunitats de reductasa, ferredoxina i oxigenasa) hidroxila l'àcid salicílic a la posició C5, formant àcid gentísic (Yamamoto et al., 1965).
Les dioxigenases incorporen dos àtoms d'O2 al substrat. Segons els productes formats, es divideixen en dioxigenases hidroxilants d'anell i dioxigenases d'escissió d'anell. Les dioxigenases hidroxilants d'anell converteixen els substrats aromàtics en cis-dihidrodiols (per exemple, naftalè) i estan molt esteses entre els bacteris. Fins ara, s'ha demostrat que els organismes que contenen dioxigenases hidroxilants d'anell són capaços de créixer en diverses fonts de carboni aromàtiques, i aquests enzims es classifiquen com a NDO (naftalè), toluè dioxigenasa (TDO, toluè) i bifenil dioxigenasa (BPDO, bifenil). Tant l'NDO com el BPDO poden catalitzar la doble oxidació i la hidroxilació de la cadena lateral de diversos hidrocarburs aromàtics policíclics (toluè, nitrotoluè, xilè, etilbenzè, naftalè, bifenil, fluorè, indol, metilnaftalè, naftalensulfonat, fenantrè, antracè, acetofenona, etc.) (Boyd i Sheldrake, 1998; Phale et al., 2020). L'NDO és un sistema multicomponent que consisteix en una oxidoreductasa, una ferredoxina i un component oxigenasa que conté un lloc actiu (Gibson i Subramanian, 1984; Resnick et al., 1996). La unitat catalítica de l'NDO consisteix en una subunitat α gran i una subunitat β petita disposades en una configuració α3β3. L'NDO pertany a una gran família d'oxigenases i la seva subunitat α conté un lloc Rieske [2Fe-2S] i un ferro mononuclear no hemo, que determina l'especificitat del substrat de l'NDO (Parales et al., 1998). Normalment, en un cicle catalític, dos electrons de la reducció del nucleòtid de piridina es transfereixen a l'ió Fe(II) del lloc actiu a través d'una reductasa, una ferredoxina i un lloc Rieske. Els equivalents reductors activen l'oxigen molecular, que és un requisit previ per a la dihidroxilació del substrat (Ferraro et al., 2005). Fins ara, només s'han purificat i caracteritzat en detall uns quants NDO a partir de diferents soques i s'ha estudiat en detall el control genètic de les vies implicades en la degradació del naftalè (Resnick et al., 1996; Parales et al., 1998; Karlsson et al., 2003). Les dioxigenases que tallen l'anell (enzims que tallen l'endo o l'orto anell i enzims que tallen l'exodiol o el meta anell) actuen sobre compostos aromàtics hidroxilats. Per exemple, la dioxigenasa que talla l'orto anell és la catecol-1,2-dioxigenasa, mentre que la dioxigenasa que talla l'anell meta és la catecol-2,3-dioxigenasa (Kojima et al., 1961; Nozaki et al., 1968). A més de diverses oxigenases, també hi ha diverses deshidrogenases responsables de la deshidrogenació de dihidrodiols aromàtics, alcohols i aldehids i que utilitzen NAD+/NADP+ com a acceptors d'electrons, que són alguns dels enzims importants implicats en el metabolisme (Gibson i Subramanian, 1984; Shaw i Harayama, 1990; Fahle et al., 2020).
Els enzims com les hidrolases (esterases, amidases) són una segona classe important d'enzims que utilitzen aigua per trencar enllaços covalents i presenten una àmplia especificitat de substrat. La carbaril hidrolasa i altres hidrolases es consideren components del periplasma (transmembrana) en membres de bacteris gramnegatius (Kamini et al., 2018). El carbaril té un enllaç amida i un enllaç èster; per tant, pot ser hidrolitzat per esterasa o amidasa per formar 1-naftol. S'ha informat que el carbaril de la soca AC10023 de Rhizobium rhizobium i la soca RC100 d'Arthrobacter funcionen com a esterasa i amidasa, respectivament. El carbaril de la soca RC100 d'Arthrobacter també funciona com a amidasa. S'ha demostrat que RC100 hidrolitza quatre insecticides de la classe N-metilcarbamat, com ara el carbaril, el metomil, l'àcid mefenàmic i el XMC (Hayaatsu et al., 2001). Es va informar que la CH en Pseudomonas sp. C5pp pot actuar sobre el carbaril (100% d'activitat) i l'acetat d'1-naftil (36% d'activitat), però no sobre l'1-naftilacetamida, cosa que indica que és una esterasa (Trivedi et al., 2016).
Estudis bioquímics, patrons de regulació enzimàtica i anàlisi genètica han demostrat que els gens de degradació del naftalè consten de dues unitats reguladores induïbles o "operons": nah (la "via aigües amunt", que converteix el naftalè en àcid salicílic) i sal (la "via aigües avall", que converteix l'àcid salicílic a la via central del carboni a través del catecol). L'àcid salicílic i els seus anàlegs poden actuar com a inductors (Shamsuzzaman i Barnsley, 1974). En presència de glucosa o àcids orgànics, l'operó es reprimeix. La figura 5 mostra l'organització genètica completa de la degradació del naftalè (en forma d'operó). S'han descrit diverses variants/formes anomenades del gen nah (ndo/pah/dox) i s'ha descobert que tenen una alta homologia de seqüència (90%) entre totes les espècies de Pseudomonas (Abbasian et al., 2016). Els gens de la via aigües amunt del naftalè es van ordenar generalment en un ordre de consens, tal com es mostra a la figura 5A. També es va informar que un altre gen, nahQ, estava implicat en el metabolisme del naftalè i que normalment es trobava entre nahC i nahE, però la seva funció real encara no s'ha dilucidat. De la mateixa manera, el gen nahY, responsable de la quimiotaxi sensible al naftalè, es va trobar a l'extrem distal de l'operó nah en alguns membres. A Ralstonia sp., es va trobar que el gen U2 que codifica la glutatió S-transferasa (gsh) es trobava entre nahAa i nahAb, però no afectava les característiques d'utilització del naftalè (Zylstra et al., 1997).
Figura 5. Organització i diversitat genètiques observades durant la degradació del naftalè entre espècies bacterianes; (A) Via superior del naftalè, metabolisme del naftalè a àcid salicílic; (B) Via inferior del naftalè, àcid salicílic via catecol fins a la via central del carboni; (C) àcid salicílic via gentisat fins a la via central del carboni.
La "via inferior" (operó sal) consisteix típicament en nahGTHINLMOKJ i converteix el salicilat en piruvat i acetaldehid a través de la via de tall per metaring de catecol. Es va trobar que el gen nahG (que codifica la salicilat hidroxilasa) estava conservat a l'extrem proximal de l'operó (Fig. 5B). En comparació amb altres soques que degraden el naftalè, a P. putida CSV86 els operons nah i sal són en tàndem i estan molt estretament relacionats (uns 7,5 kb). En alguns bacteris gramnegatius, com ara Ralstonia sp. U2, Polaromonas naphthalenivorans CJ2 i P. putida AK5, el naftalè es metabolitza com a metabòlit central de carboni a través de la via del gentisat (en forma de l'operó sgp/nag). El casset gènic es representa típicament en la forma nagAaGHAbAcAdBFCQEDJI, on nagR (que codifica un regulador de tipus LysR) es troba a l'extrem superior (Figura 5C).
El carbaril entra al cicle central del carboni a través del metabolisme de l'1-naftol, l'1,2-dihidroxinaftalè, l'àcid salicílic i l'àcid gentísic (Figura 3). Basant-se en estudis genètics i metabòlics, s'ha proposat dividir aquesta via en "aigües amunt" (conversió de carbaril a àcid salicílic), "intermèdia" (conversió d'àcid salicílic a àcid gentísic) i "aigües avall" (conversió d'àcid gentísic a intermediaris de la via central del carboni) (Singh et al., 2013). L'anàlisi genòmica de C5pp (supercontig A, 76.3 kb) va revelar que el gen mcbACBDEF està implicat en la conversió de carbaril a àcid salicílic, seguit de mcbIJKL en la conversió d'àcid salicílic a àcid gentísic, i mcbOQP en la conversió d'àcid gentísic a intermediaris de carboni central (fumarat i piruvat, Trivedi et al., 2016) (Figura 6).
S'ha informat que els enzims implicats en la degradació d'hidrocarburs aromàtics (inclosos el naftalè i l'àcid salicílic) poden ser induïts pels compostos corresponents i inhibits per fonts de carboni simples com la glucosa o els àcids orgànics (Shingler, 2003; Phale et al., 2019, 2020). Entre les diverses vies metabòliques del naftalè i els seus derivats, s'han estudiat fins a cert punt les característiques reguladores del naftalè i el carbaril. Per al naftalè, els gens tant de la via aigües amunt com de la via aigües avall estan regulats per NahR, un regulador positiu transactiu de tipus LysR. És necessari per a la inducció del gen nah per l'àcid salicílic i la seva posterior expressió d'alt nivell (Yen i Gunsalus, 1982). A més, estudis han demostrat que el factor hoste integratiu (IHF) i XylR (regulador transcripcional dependent de sigma 54) també són crítics per a l'activació transcripcional de gens en el metabolisme del naftalè (Ramos et al., 1997). Estudis han demostrat que els enzims de la via d'obertura de l'anell metacateòlic, és a dir, la catecol 2,3-dioxigenasa, s'indueixen en presència de naftalè i/o àcid salicílic (Basu et al., 2006). Estudis han demostrat que els enzims de la via d'obertura de l'anell ortocateòlic, és a dir, la catecol 1,2-dioxigenasa, s'indueixen en presència d'àcid benzoic i cis,cis-muconat (Parsek et al., 1994; Tover et al., 2001).
En la soca C5pp, cinc gens, mcbG, mcbH, mcbN, mcbR i mcbS, codifiquen reguladors que pertanyen a la família de reguladors transcripcionals LysR/TetR responsables de controlar la degradació del carbaril. Es va trobar que el gen homòleg mcbG estava més estretament relacionat amb el regulador de tipus LysR PhnS (58% d'identitat d'aminoàcids) implicat en el metabolisme del fenantrè en Burkholderia RP00725 (Trivedi et al., 2016). Es va trobar que el gen mcbH estava implicat en la via intermèdia (conversió d'àcid salicílic a àcid gentísic) i pertany al regulador transcripcional de tipus LysR NagR/DntR/NahR en Pseudomonas i Burkholderia. Es va informar que els membres d'aquesta família reconeixen l'àcid salicílic com una molècula efectora específica per a la inducció de gens de degradació. D'altra banda, es van identificar tres gens, mcbN, mcbR i mcbS, pertanyents als reguladors transcripcionals de tipus LysR i TetR, a la via descendent (metabolits de la via del carboni central del gentisat).
En els procariotes, els processos de transferència horitzontal de gens (adquisició, intercanvi o transferència) a través de plasmidis, transposons, profags, illes genòmiques i elements conjugatius integratius (ICE) són les principals causes de plasticitat en els genomes bacterians, que condueixen al guany o pèrdua de funcions/trets específics. Permet als bacteris adaptar-se ràpidament a diferents condicions ambientals, proporcionant potencials avantatges metabòlics adaptatius a l'hoste, com ara la degradació de compostos aromàtics. Els canvis metabòlics sovint s'aconsegueixen mitjançant l'ajust fi dels operons de degradació, els seus mecanismes reguladors i les especificitats enzimàtiques, cosa que facilita la degradació d'una gamma més àmplia de compostos aromàtics (Nojiri et al., 2004; Phale et al., 2019, 2020). S'ha descobert que els cassets gènics per a la degradació del naftalè es troben en una varietat d'elements mòbils com ara plasmidis (conjugatius i no conjugatius), transposons, genomes, ICE i combinacions de diferents espècies bacterianes (Figura 5). En Pseudomonas G7, els operons nah i sal del plasmidi NAH7 es transcriuen en la mateixa orientació i formen part d'un transposó defectuós que requereix la transposasa Tn4653 per a la mobilització (Sota et al., 2006). En la soca de Pseudomonas NCIB9816-4, el gen es va trobar al plasmidi conjugatiu pDTG1 com a dos operons (aproximadament a 15 kb de distància) que es van transcriure en direccions oposades (Dennis i Zylstra, 2004). En la soca de Pseudomonas putida AK5, el plasmidi no conjugatiu pAK5 codifica l'enzim responsable de la degradació del naftalè a través de la via del gentisat (Izmalkova et al., 2013). En la soca de Pseudomonas PMD-1, l'operó nah es troba al cromosoma, mentre que l'operó sal es troba al plasmidi conjugatiu pMWD-1 (Zuniga et al., 1981). Tanmateix, a Pseudomonas stutzeri AN10, tots els gens de degradació de naftalè (operons nah i sal) es troben al cromosoma i presumiblement es recluten mitjançant esdeveniments de transposició, recombinació i reordenament (Bosch et al., 2000). A Pseudomonas sp. CSV86, els operons nah i sal es troben al genoma en forma d'ICE (ICECSV86). L'estructura està protegida per tRNAGly seguida de repeticions directes que indiquen llocs de recombinació/unió (attR i attL) i una integrasa semblant a un fag situada a tots dos extrems de tRNAGly, per tant estructuralment similar a l'element ICEclc (ICEclcB13 a Pseudomonas knackmusii per a la degradació del clorocatecol). S'ha informat que els gens de l'ICE es poden transferir per conjugació amb una freqüència de transferència extremadament baixa (10-8), transferint així les propietats de degradació al receptor (Basu i Phale, 2008; Phale et al., 2019).
La majoria dels gens responsables de la degradació del carbaril es troben en plasmidis. Arthrobacter sp. RC100 conté tres plasmidis (pRC1, pRC2 i pRC300), dels quals dos plasmidis conjugatius, pRC1 i pRC2, codifiquen els enzims que converteixen el carbaril en gentisat. D'altra banda, els enzims implicats en la conversió del gentisat als metabòlits de carboni centrals es troben al cromosoma (Hayaatsu et al., 1999). Bacteris del gènere Rhizobium. La soca AC100, utilitzada per a la conversió del carbaril en 1-naftol, conté el plasmidi pAC200, que porta el gen cehA que codifica CH com a part del transposó Tnceh envoltat de seqüències semblants a elements d'inserció (istA i istB) (Hashimoto et al., 2002). A la soca CF06 de *Sphingomonas*, es creu que el gen de degradació del carbaril és present en cinc plasmidis: pCF01, pCF02, pCF03, pCF04 i pCF05. L'homologia de l'ADN d'aquests plasmidis és alta, cosa que indica l'existència d'un esdeveniment de duplicació gènica (Feng et al., 1997). En un simbiont degradant el carbaril compost per dues espècies de *Pseudomonas*, la soca 50581 conté un plasmidi conjugatiu pCD1 (50 kb) que codifica el gen mcd de la carbaril hidrolasa, mentre que el plasmidi conjugatiu de la soca 50552 codifica un enzim degradant l'1-naftol (Chapalamadugu i Chaudhry, 1991). A la soca WM111 d'*Achromobacter*, el gen mcd furadan hidrolasa es troba en un plasmidi de 100 kb (pPDL11). S'ha demostrat que aquest gen és present en diferents plasmidis (100, 105, 115 o 124 kb) en diferents bacteris de diferents regions geogràfiques (Parekh et al., 1995). A Pseudomonas sp. C5pp, tots els gens responsables de la degradació del carbaril es troben en un genoma que abasta 76,3 kb de seqüència (Trivedi et al., 2016). L'anàlisi del genoma (6,15 Mb) va revelar la presència de 42 MGE i 36 GEI, dels quals 17 MGE es van trobar al supercontig A (76,3 kb) amb un contingut mitjà de G+C asimètric (54-60 mol%), cosa que suggereix possibles esdeveniments de transferència horitzontal de gens (Trivedi et al., 2016). P. putida XWY-1 presenta una disposició similar de gens que degraden el carbaril, però aquests gens es troben en un plasmidi (Zhu et al., 2019).
A més de l'eficiència metabòlica a nivell bioquímic i genòmic, els microorganismes també presenten altres propietats o respostes com la quimiotaxi, les propietats de modificació de la superfície cel·lular, la compartimentació, la utilització preferencial, la producció de biotensioactius, etc., que els ajuden a metabolitzar de manera més eficient els contaminants aromàtics en ambients contaminats (Figura 7).
Figura 7. Diferents estratègies de resposta cel·lular de bacteris ideals que degraden hidrocarburs aromàtics per a una biodegradació eficient de compostos contaminants estranys.
Les respostes quimiotàctiques es consideren factors que milloren la degradació de contaminants orgànics en ecosistemes heterogèniament contaminats. (2002) va demostrar que la quimiotaxi de Pseudomonas sp. G7 al naftalè augmentava la taxa de degradació del naftalè en sistemes aquàtics. La soca de tipus salvatge G7 degradava el naftalè molt més ràpidament que una soca mutant amb deficiència de quimiotaxi. Es va trobar que la proteïna NahY (538 aminoàcids amb topologia de membrana) estava cotranscrita amb els gens de la via metacleavage al plasmidi NAH7, i com els transductors de quimiotaxi, aquesta proteïna sembla funcionar com a quimioreceptor per a la degradació del naftalè (Grimm i Harwood 1997). Un altre estudi de Hansel et al. (2009) va mostrar que la proteïna és quimiotàctica, però la seva taxa de degradació és alta. (2011) va demostrar una resposta quimiotàctica de Pseudomonas (P. putida) al naftalè gasós, en què la difusió en fase gasosa va resultar en un flux constant de naftalè a les cèl·lules, que controlava la resposta quimiotàctica de les cèl·lules. Els investigadors van explotar aquest comportament quimiotàctic per dissenyar microbis que augmentessin la velocitat de degradació. Els estudis han demostrat que les vies quimiosensorials també regulen altres funcions cel·lulars com la divisió cel·lular, la regulació del cicle cel·lular i la formació de biofilms, ajudant així a controlar la velocitat de degradació. Tanmateix, l'aprofitament d'aquesta propietat (quimiotaxi) per a una degradació eficient es veu obstaculitzat per diversos colls d'ampolla. Els principals obstacles són: (a) diferents receptors paràlegs reconeixen els mateixos compostos/lligands; (b) existència de receptors alternatius, és a dir, tropisme energètic; (c) diferències de seqüència significatives en els dominis sensorials de la mateixa família de receptors; i (d) manca d'informació sobre les principals proteïnes sensores bacterianes (Ortega et al., 2017; Martin-Mora et al., 2018). De vegades, la biodegradació d'hidrocarburs aromàtics produeix múltiples metabòlits/intermediaris, que poden ser quimiotàctics per a un grup de bacteris però repulsius per a altres, cosa que complica encara més el procés. Per identificar les interaccions dels lligands (hidrocarburs aromàtics) amb receptors químics, vam construir proteïnes sensores híbrides (PcaY, McfR i NahY) fusionant els dominis sensor i de senyalització de Pseudomonas putida i Escherichia coli, que es dirigeixen als receptors d'àcids aromàtics, intermediaris TCA i naftalè, respectivament (Luu et al., 2019).
Sota la influència del naftalè i altres hidrocarburs aromàtics policíclics (HAP), l'estructura de la membrana bacteriana i la integritat dels microorganismes experimenten canvis significatius. Els estudis han demostrat que el naftalè interfereix amb la interacció de la cadena acil a través d'interaccions hidrofòbiques, augmentant així la inflor i la fluïdesa de la membrana (Sikkema et al., 1995). Per contrarestar aquest efecte perjudicial, els bacteris regulen la fluïdesa de la membrana canviant la proporció i la composició d'àcids grassos entre els àcids grassos de cadena ramificada iso/anteiso i isomeritzant els àcids grassos cis-insaturats en els isòmers trans corresponents (Heipieper i de Bont, 1994). En Pseudomonas stutzeri cultivada amb tractament amb naftalè, la proporció d'àcids grassos saturats i insaturats va augmentar d'1,1 a 2,1, mentre que en Pseudomonas JS150 aquesta proporció va augmentar de 7,5 a 12,0 (Mrozik et al., 2004). Quan es van cultivar en naftalè, les cèl·lules d'Achromobacter KAs 3–5 van mostrar agregació cel·lular al voltant dels cristalls de naftalè i una disminució de la càrrega superficial cel·lular (de -22,5 a -2,5 mV) acompanyada de condensació citoplasmàtica i vacuolització, cosa que indica canvis en l'estructura cel·lular i les propietats de la superfície cel·lular (Mohapatra et al., 2019). Tot i que els canvis cel·lulars/superficials estan directament associats amb una millor absorció de contaminants aromàtics, les estratègies de bioenginyeria rellevants no s'han optimitzat completament. La manipulació de la forma cel·lular poques vegades s'ha utilitzat per optimitzar els processos biològics (Volke i Nikel, 2018). L'eliminació de gens que afecten la divisió cel·lular provoca canvis en la morfologia cel·lular. L'eliminació de gens que afecten la divisió cel·lular provoca canvis en la morfologia cel·lular. En Bacillus subtilis, s'ha demostrat que la proteïna SepF del septe cel·lular està implicada en la formació del septe i és necessària per als passos posteriors de la divisió cel·lular, però no és un gen essencial. L'eliminació de gens que codifiquen les hidrolases peptídiques de glicà en Bacillus subtilis va provocar un allargament cel·lular, un augment de la taxa de creixement específica i una millora de la capacitat de producció d'enzims (Cui et al., 2018).
S'ha proposat la compartimentació de la via de degradació del carbaril per aconseguir una degradació eficient de les soques de Pseudomonas C5pp i C7 (Kamini et al., 2018). Es proposa que el carbaril es transporti a l'espai periplàsmic a través del septe de la membrana externa i/o a través de porines difusibles. La CH és un enzim periplàsmic que catalitza la hidròlisi del carbaril a 1-naftol, que és més estable, més hidròfob i més tòxic. La CH es localitza al periplasma i té una baixa afinitat pel carbaril, controlant així la formació d'1-naftol, evitant així la seva acumulació a les cèl·lules i reduint la seva toxicitat per a les cèl·lules (Kamini et al., 2018). L'1-naftol resultant es transporta al citoplasma a través de la membrana interna per partició i/o difusió, i després s'hidroxila a 1,2-dihidroxinaftalè per l'enzim d'alta afinitat 1NH per a un metabolisme posterior a la via central del carboni.
Tot i que els microorganismes tenen les capacitats genètiques i metabòliques per degradar fonts de carboni xenobiòtiques, l'estructura jeràrquica de la seva utilització (és a dir, l'ús preferencial de fonts de carboni simples sobre complexes) és un obstacle important per a la biodegradació. La presència i la utilització de fonts de carboni simples regula a la baixa els gens que codifiquen enzims que degraden fonts de carboni complexes/no preferides com els HAP. Un exemple ben estudiat és que quan es coalimenta glucosa i lactosa a Escherichia coli, la glucosa s'utilitza de manera més eficient que la lactosa (Jacob i Monod, 1965). S'ha informat que Pseudomonas degrada una varietat d'HAP i compostos xenobiòtics com a fonts de carboni. La jerarquia d'utilització de fonts de carboni a Pseudomonas és àcids orgànics > glucosa > compostos aromàtics (Hylemon i Phibbs, 1972; Collier et al., 1996). Tanmateix, hi ha una excepció. Curiosament, Pseudomonas sp. El CSV86 presenta una estructura jeràrquica única que utilitza preferentment hidrocarburs aromàtics (àcid benzoic, naftalè, etc.) en lloc de glucosa i cometabolitza hidrocarburs aromàtics amb àcids orgànics (Basu et al., 2006). En aquest bacteri, els gens per a la degradació i el transport d'hidrocarburs aromàtics no estan regulats a la baixa, fins i tot en presència d'una segona font de carboni com la glucosa o els àcids orgànics. Quan es va cultivar en un medi de glucosa i hidrocarburs aromàtics, es va observar que els gens per al transport i el metabolisme de la glucosa estaven regulats a la baixa, els hidrocarburs aromàtics es van utilitzar a la primera fase logarítmica i la glucosa es va utilitzar a la segona fase logarítmica (Basu et al., 2006; Choudhary et al., 2017). D'altra banda, la presència d'àcids orgànics no va afectar l'expressió del metabolisme dels hidrocarburs aromàtics, per la qual cosa s'espera que aquest bacteri sigui una soca candidata per a estudis de biodegradació (Phale et al., 2020).
És ben sabut que la biotransformació d'hidrocarburs pot causar estrès oxidatiu i regulació a l'alça dels enzims antioxidants en els microorganismes. La biodegradació ineficient del naftalè, tant en cèl·lules en fase estacionària com en presència de compostos tòxics, condueix a la formació d'espècies reactives d'oxigen (ROS) (Kang et al. 2006). Com que els enzims que degraden el naftalè contenen clústers de ferro-sofre, sota estrès oxidatiu, el ferro de l'hemo i les proteïnes de ferro-sofre s'oxidarà, cosa que provocarà la inactivació de les proteïnes. La ferredoxina-NADP+ reductasa (Fpr), juntament amb la superòxid dismutasa (SOD), media la reacció redox reversible entre NADP+/NADPH i dues molècules de ferredoxina o flavodoxina, eliminant així les ROS i restaurant el centre de ferro-sofre sota estrès oxidatiu (Li et al. 2006). S'ha informat que tant Fpr com SodA (SOD) en Pseudomonas poden ser induïdes per estrès oxidatiu, i es va observar un augment de les activitats de SOD i catalasa en quatre soques de Pseudomonas (O1, W1, As1 i G1) durant el creixement en condicions d'addició de naftalè (Kang et al., 2006). Els estudis han demostrat que l'addició d'antioxidants com l'àcid ascòrbic o el ferro ferrós (Fe2+) pot augmentar la taxa de creixement del naftalè. Quan Rhodococcus erythropolis va créixer en medi de naftalè, es va augmentar la transcripció dels gens del citocrom P450 relacionats amb l'estrès oxidatiu, incloent sodA (Fe/Mn superòxid dismutasa), sodC (Cu/Zn superòxid dismutasa) i recA (Sazykin et al., 2019). L'anàlisi proteòmica quantitativa comparativa de cèl·lules de Pseudomonas cultivades en naftalè va mostrar que la regulació a l'alça de diverses proteïnes associades amb la resposta a l'estrès oxidatiu és una estratègia d'afrontament de l'estrès (Herbst et al., 2013).
S'ha informat que els microorganismes produeixen biotensioactius sota l'acció de fonts de carboni hidrofòbiques. Aquests tensioactius són compostos tensioactius amfifílics que poden formar agregats a les interfícies oli-aigua o aire-aigua. Això promou la pseudosolubilització i facilita l'adsorció d'hidrocarburs aromàtics, donant lloc a una biodegradació eficient (Rahman et al., 2002). A causa d'aquestes propietats, els biotensioactius s'utilitzen àmpliament en diverses indústries. L'addició de tensioactius químics o biotensioactius als cultius bacterians pot millorar l'eficiència i la velocitat de degradació dels hidrocarburs. Entre els biotensioactius, els ramnolípids produïts per Pseudomonas aeruginosa han estat àmpliament estudiats i caracteritzats (Hisatsuka et al., 1971; Rahman et al., 2002). A més, altres tipus de biotensioactius inclouen lipopèptids (mucines de Pseudomonas fluorescens), emulsionant 378 (de Pseudomonas fluorescens) (Rosenberg i Ron, 1999), lípids de disacàrids de trehalosa de Rhodococcus (Ramdahl, 1985), liquenina de Bacillus (Saraswathy i Hallberg, 2002) i tensioactiu de Bacillus subtilis (Siegmund i Wagner, 1991) i Bacillus amyloliquefaciens (Zhi et al., 2017). S'ha demostrat que aquests potents tensioactius redueixen la tensió superficial de 72 dines/cm a menys de 30 dines/cm, permetent una millor absorció d'hidrocarburs. S'ha informat que Pseudomonas, Bacillus, Rhodococcus, Burkholderia i altres espècies bacterianes poden produir diversos biotensioactius basats en ramnolípids i glicolípids quan es cultiven en medis de naftalè i metilnaftalè (Kanga et al., 1997; Puntus et al., 2005). Pseudomonas maltophilia CSV89 pot produir el biotensioactiu extracel·lular Biosur-Pm quan es cultiva en compostos aromàtics com l'àcid naftoic (Phale et al., 1995). La cinètica de formació de Biosur-Pm va mostrar que la seva síntesi és un procés dependent del creixement i del pH. Es va trobar que la quantitat de Biosur-Pm produïda per les cèl·lules a pH neutre era més alta que la de pH 8,5. Les cèl·lules cultivades a pH 8,5 eren més hidròfobes i tenien una major afinitat pels compostos aromàtics i alifàtics que les cèl·lules cultivades a pH 7,0. En Rhodococcus spp. L'N6, una major relació carboni-nitrogen (C:N) i la limitació del ferro són condicions òptimes per a la producció de biotensioactius extracel·lulars (Mutalik et al., 2008). S'han fet intents per millorar la biosíntesi de biotensioactius (tensioactius) optimitzant les soques i la fermentació. Tanmateix, el títol de tensioactiu en el medi de cultiu és baix (1,0 g/L), cosa que planteja un repte per a la producció a gran escala (Jiao et al., 2017; Wu et al., 2019). Per tant, s'han utilitzat mètodes d'enginyeria genètica per millorar la seva biosíntesi. Tanmateix, la seva modificació per enginyeria és difícil a causa de la gran mida de l'operó (∼25 kb) i la complexa regulació biosintètica del sistema de detecció de quòrum (Jiao et al., 2017; Wu et al., 2019). S'han dut a terme diverses modificacions d'enginyeria genètica en bacteris Bacillus, principalment destinades a augmentar la producció de surfactina substituint el promotor (operó srfA), sobreexpressant la proteïna d'exportació de surfactina YerP i els factors reguladors ComX i PhrC (Jiao et al., 2017). Tanmateix, aquests mètodes d'enginyeria genètica només han aconseguit una o unes poques modificacions genètiques i encara no han arribat a la producció comercial. Per tant, cal un estudi més aprofundit dels mètodes d'optimització basats en el coneixement.
Els estudis de biodegradació de HAP es duen a terme principalment en condicions de laboratori estàndard. Tanmateix, en llocs contaminats o en ambients contaminats, s'ha demostrat que molts factors abiòtics i biòtics (temperatura, pH, oxigen, disponibilitat de nutrients, biodisponibilitat del substrat, altres xenobiòtics, inhibició del producte final, etc.) alteren i influeixen en la capacitat degradativa dels microorganismes.
La temperatura té un efecte significatiu en la biodegradació dels HAP. A mesura que augmenta la temperatura, la concentració d'oxigen dissolt disminueix, cosa que afecta el metabolisme dels microorganismes aeròbics, ja que requereixen oxigen molecular com un dels substrats de les oxigenases que duen a terme reaccions d'hidroxilació o d'escissió d'anell. Sovint es nota que una temperatura elevada converteix els HAP originals en compostos més tòxics, inhibint així la biodegradació (Muller et al., 1998).
S'ha observat que molts llocs contaminats amb HAP tenen valors de pH extrems, com ara llocs contaminats per drenatge àcid de mines (pH 1-4) i llocs de gasificació de gas natural/carbó contaminats amb lixiviats alcalins (pH 8-12). Aquestes condicions poden afectar greument el procés de biodegradació. Per tant, abans d'utilitzar microorganismes per a la biorremediació, es recomana ajustar el pH afegint productes químics adequats (amb potencial d'oxidació-reducció de moderat a molt baix) com ara sulfat d'amoni o nitrat d'amoni per a sòls alcalins o encalat amb carbonat de calci o carbonat de magnesi per a llocs àcids (Bowlen et al. 1995; Gupta i Sar 2020).
El subministrament d'oxigen a la zona afectada és el factor limitant de la biodegradació dels HAP. A causa de les condicions redox del medi ambient, els processos de biorremediació in situ solen requerir la introducció d'oxigen de fonts externes (llaurat, burbujeig d'aire i addició química) (Pardieck et al., 1992). Odenkranz et al. (1996) van demostrar que l'addició de peròxid de magnesi (un compost alliberador d'oxigen) a un aqüífer contaminat podia biorremediar eficaçment els compostos BTEX. Un altre estudi va investigar la degradació in situ del fenol i el BTEX en un aqüífer contaminat mitjançant la injecció de nitrat de sodi i la construcció de pous d'extracció per aconseguir una biorremediació eficaç (Bewley i Webb, 2001).