Actual†Adreça actual: OX11 0DE, Regne Unit, Diamond Building, Harwell Science and Innovation Park, Dietcote, Oxfordshire, Regne Unit, Diamond Light Source Co., Ltd., Electronic Biological Imaging Center.
El complex 1 de recol·lecció de llum del centre de reacció (RC-LH1) és el component fotosintètic central dels bacteris fototròfics porpres. Vam introduir dues estructures de criomicroscòpia electrònica del complex RC-LH1 de Rhodopseudomonas palustris. L'estructura de resolució de 2,65 Å del complex RC-LH114-W consta de 14 bucles de subunitats LH1 que envolten RC, que està interromput per la proteïna W, mentre que el complex sense proteïna W té una composició RC completament envoltada per RC. Bucle LH1 tancat de 16 subunitats. La comparació d'aquestes estructures proporciona informació sobre la dinàmica de la quinona en el complex RC-LH1, incloent-hi canvis conformacionals prèviament no determinats en unir-se a la quinona al lloc QB RC, així com la ubicació dels llocs auxiliars d'unió de quinona, que ajuden a passar-los a RC. L'estructura única de la proteïna W impedeix el tancament del bucle LH1, creant així un canal per accelerar l'intercanvi de quinona/quinolona.
L'energia proporcionada per la fotosíntesi pot sostenir gairebé tota la vida a la Terra i té un gran potencial per a la biotecnologia solar. Tot i que promouen la fotosíntesi global, els bacteris fototròfics porpres també presenten diversos modes energètics i capacitats metabòliques. Poden evitar la fotosíntesi i créixer com a bacteris heteròtrofs a la foscor, poden fixar nitrogen i diòxid de carboni, produir hidrogen i degradar compostos aromàtics (1-3). Per tal de proporcionar energia per a aquests processos, la llum s'ha de convertir de manera ràpida i eficient en energia química. Aquest procés comença quan el complex d'antena que atrapa la llum absorbeix la llum i transfereix l'energia atrapada al centre de reacció (RC), iniciant així la separació de càrrega (4-7). La unitat bàsica de la fotosíntesi en els bacteris fototròfics porpres està composta per RC de tipus 2, envoltada pel complex de recol·lecció de llum 1 (LH1), formant el complex central RC-LH1. LH1 està format per una matriu d'heterodímers αβ corbats, cadascun dels quals s'uneix a dues molècules de clorofil·la bacteriana (BChl) a i un o dos carotenoides (8-12). L'antena LH1 més simple consta de 16 o 17 heterodímers αβ que envolten RC (9-13) en un bucle tancat, però en altres complexos centrals, els pèptids transmembrana interrompen la continuïtat de l'LH1 circumdant, promovent així la difusió de quinol/quinona entre RC i el complex del citocrom bc1 (11, 13-15). La planta fototròfica porpra Rhodopseudomonas (Rps.) és un organisme model que pot entendre la transferència d'energia i electrons que suporta la fotosíntesi. La primera estructura cristal·lina de Rps. El model del complex RC-LH1 de palustris és RC, envoltat per 15 bucles LH1 heterodimèrics, que estan interromputs per una proteïna desconeguda anomenada "Proteïna W" (14). La proteïna W es va identificar posteriorment com a RPA4402, que és una proteïna de 10,5 kDa no caracteritzada amb tres hèlixs transmembrana (TMH) predites (16). Proposem canviar el nom del gen rpa4402 que codifica la proteïna W a pufW per tal de ser coherent amb la nomenclatura utilitzada per als gens que codifiquen les subunitats RC-L, M (pufL, pufM) i LH1α, β (pufA, pufB). Curiosament, la proteïna W només és present en aproximadament el 10% de RC-LH1, cosa que revela que Rps. palustris produeix dos complexos RC-LH1 diferents. Aquí, informem de les estructures crio-EM (crio-EM) d'alta resolució de dos complexos centrals, un amb proteïna W i 14 heterodímers αβ, l'altre sense proteïna W i un bucle LH1 tancat de 16 heterodímers. La nostra estructura representa un canvi radical en la comprensió del complex RC-LH1 de Rps. palustris, perquè hem analitzat la població homogènia de cada variant i tenim una resolució suficient per assignar clarament cada pèptid i els pigments units, així com els lípids i les quinones relacionades. La comparació d'aquestes estructures mostra que les tres proteïnes TMH-W que no s'han trobat fins ara en cap altre complex RC-LH1 generen un canal de quinona per accelerar l'intercanvi de quinona/quinolona. S'han identificat diversos llocs d'unió de lípids i quinones conservats, i hem revelat un nou canvi conformacional després de la combinació de quinona i RC, que pot ser adequat per a la RC del fotosistema II (PSII) d'organismes fototròfics oxigenats. Els nostres resultats proporcionen nous coneixements sobre la cinètica de la unió i l'intercanvi de quinona/quinolona en el complex central RC-LH1 dels bacteris fototròfics porpres.
Per tal de facilitar un estudi detallat dels dos complexos trobats a Rps. palustris, aïllem cada RC-LH1 mitjançant mètodes bioquímics. El complex deficient en proteïna W (d'ara endavant anomenat ΔpufW) es va purificar de la soca que no tenia el gen pufW (16), i només es pot produir un complex RC-LH1. El complex que conté la proteïna W és produït per una soca. La proteïna W d'aquesta soca es modifica amb una etiqueta His 10x al seu extrem C-terminal, de manera que el complex que conté la proteïna W es pot combinar eficaçment amb la majoria de les proteïnes W que no hi són mitjançant la immobilització del metall. El complex es separa eficaçment (16) Cromatografia d'afinitat (IMAC).
Com es mostra a la Figura 1, ambdós complexos contenen un RC de tres subunitats (RC-L, RC-M i RC-H) envoltat per una antena LH1. L'estructura de 2,80 Å del complex que no té proteïna W mostra 16 heterodímers αβ, formant un bucle LH1 tancat que envolta completament RC, d'ara endavant anomenat complex RC-LH116. L'estructura de 2,65 Å del complex que conté proteïna W té un LH1 de 14 heterodímers interromput per la proteïna W, d'ara endavant anomenat RC-LH114-W.
(A i B) Representació superficial del compost. (C i D) Pigments enllaçats expressats en bastonets. (E i F) Els complexos observats des de la superfície citoplasmàtica tenen els pèptids i les subunitats LH1 representats en dibuixos animats, i estan numerats en sentit horari des del buit proteïna-W [coherent amb la numeració Rba. Complex sphaeroides (13)]. Per a LH1-α, el color de la subunitat proteïna és groc; per a LH1-β, el color de la subunitat proteïna és blau; per a la proteïna-W, la proteïna és vermella; per a RC-H, és cian; per a RC-L, és taronja; per a RC-M, magenta. Els cofactors estan representats per bastonets, el verd representa les molècules de BChl i BPh a, el porpra representa els carotenoides i el groc representa les molècules d'UQ10. (G i H) Vista ampliada del buit proteïna-W a la regió equivalent del complex RC-LH114-W (G) i del complex RC-LH116 (H). Els cofactors es mostren en forma d'ompliment d'espai, la quinona quelada es mostra en blau. El buit proteïna-W està ressaltat per una línia discontínua blava a (G), i els petits forats on la quinona/quinolol es difon a l'anell LH116 estan ressaltats per una línia discontínua negra a (H).
La Figura 1 (A i B) mostra l'RC envoltat per matrius obertes o tancades d'heterodímers LH1αβ, cadascun dels quals s'uneix a dos BChl i un carotenoide (Figura 1, C i D). Estudis previs han demostrat que Rps és el complex LH1. En la via biosintètica de la xantina d'espirulina, aquestes espècies contenen poblacions mixtes de carotenoides (17). Tanmateix, l'espiropiroxantina és el carotenoide dominant i la seva densitat és satisfactòria. Per tant, vam optar per modelar l'espiroxantina en tots els llocs d'unió de LH1. Els polipèptids alfa i beta són TMH individuals amb regions externes de membrana curtes (Figura 1, A, B, E i F). Tot i que no es va observar la densitat de 17 residus a l'extrem C-terminal, el polipèptid alfa es va dividir de Met1 a Ala46 en ambdós complexos. El polipèptid β es va reduir de Gly4 a Tyr52 en RC-LH116 i de Ser5 a Tyr52 en RC-LH114-W. No es va observar cap densitat de 3 o 4 residus N-terminals ni 13 C-terminals (Figura S1). L'anàlisi per espectrometria de masses del complex mixt RC-LH1 preparat a partir de la soca de tipus salvatge va mostrar que la regió que faltava era el resultat de l'escissió heteròloga d'aquests pèptids (Figura S1 i S2). També es va observar la formilació N-terminal d'α-Met1 (f). L'anàlisi va mostrar que l'α-pèptid consisteix en residus fMet1 a Asp42/Ala46/Ala47/Ala50, i el β-pèptid consisteix en residus Ser2 a Ala53, la qual cosa concorda amb el mapa de densitat EM de baixa temperatura.
La coordinació d'α-His29 i β-His36 fa que els BChls estiguin cara a cara; cada heterodímer αβ s'uneix amb els seus veïns per formar un bucle obert (RC-LH114-W) o un bucle tancat (RC-LH116) al voltant de la matriu de pigments acoblats a excitons RC (Figura 1, C i D). En comparació amb la banda de 877 nm de RC-LH114-W, el desplaçament cap al vermell d'absorció de 880 nm de RC-LH116 és de 3 nm (Figura 2A). Tanmateix, l'espectre de dicroisme circular és gairebé el mateix (Figura 2B), cosa que indica que, tot i que hi ha una clara diferència entre els bucles oberts i tancats, l'entorn local dels BChls és molt similar. El desplaçament cap al vermell d'absorció pot ser el resultat d'una reducció del moviment tèrmic i una major estabilitat en el bucle tancat (18, 19), el canvi en l'acoblament de pigments causat pel bucle tancat (20, 21) o una combinació d'aquests dos efectes (11).
(A) Espectre d'absorció ultraviolada/visible/infraroig proper, els pics del qual estan marcats amb els seus pigments corresponents i normalitzats al pic BPh a 775 nm. (B) Espectre de dicroisme circular normalitzat a l'absorbància de BChl a 805 nm. (C i D) Espectres ΔA seleccionats dels espectres d'absorció resolts en el temps del complex RC-LH114-W (C) i del complex RC-LH116 (D). Per a una millor comparabilitat, tots els espectres estan normalitzats a ∆A de −A a 0,2 ps. (E) La taxa d'oxidació del citocrom c2 després de la irradiació en presència de diverses concentracions d'UQ2 (vegeu la Figura S8 per a dades en brut). (F) En cèl·lules cultivades sota llum de baixa, mitjana o alta intensitat (10, 30 o 300 μMm-2 s-1, respectivament), les subunitats de la proteïna W i RC-L del complex purificat i la proporció de membrana separada. Determineu el nivell de proteïna mitjançant electroforesi en gel de SDS-poliacrilamida i immunoassaig (vegeu la Figura S9 per a les dades en brut). Determineu la proporció respecte al complex RC-LH114-W purificat. La proporció estequiomètrica de RC-L a proteïna-W del complex és d'1:1.
Els BChls a la posició 1 del bucle αβ14 deformat de RC-LH114-W (Figura 1, A, C i E) són 6,8 Å més a prop del donant primari RC (P) que els BChls equivalents a RC-LH116 (Figura 1, B, D i F, i Figura S3); tanmateix, la cinètica d'absorció transitòria dels dos complexos mostra que per a RC-LH114-W i RC-LH116, les constants de temps de transferència d'energia d'excitació de LH1 a RC són de 40 ± 4 i 44 ± 3 ps (Figura 2). , C i D, Figura S4 i Taula S2). Tampoc hi ha cap diferència significativa en la transferència electrònica dins de RC (Figura S5 i text suplementari relacionat). Sospitem que l'estreta correspondència del temps de transferència d'energia entre LH1 i RC-P es deu a la distància, l'angle i l'energia potencial similars de la majoria dels BChl en els dos bucles LH1. Sembla que explorar el patró d'energia LH1 per assolir la distància mínima no és més ràpid que la transferència directa d'energia des de llocs subòptims a RC. El bucle LH1 de bucle obert a RC-LH114-W també pot experimentar un moviment tèrmic insignificant en condicions de baixa temperatura per a l'anàlisi estructural, i hi ha una conformació d'anell αβ14 més llarga a temperatura ambient a partir de la distància de pigmentació de βBChls a la posició de RC 1.
El complex RC-LH116 conté 32 BChls i 16 carotenoides, i la seva disposició general és la mateixa que la que s'ha obtingut de Thermochromatium (Tch.) pidpidum [Protein Data Bank (PDB) ID 5Y5S] (9), la soca Thiorhodovibrio (Trv.) 970 (PDB ID 7C9R) (12) i les algues verdes (Blc.viridis) (PDB ID 6ET5) (10). Després de l'alineació, només es van observar petites desviacions en les posicions dels heterodímers αβ, especialment 1-5, 15 i 16 (Figura S6). La presència de proteïna W té un impacte significatiu en l'estructura de LH1. Els seus tres TMH estan connectats per bucles curts, amb l'extrem N-terminal al costat del lumen del complex i el C-terminal al costat citoplasmàtic (Figures 1A i 3, A a D). La proteïna W és en gran part hidrofòbica (Figura 3B), i TMH2 i TMH3 interactuen amb LH1αβ-14 per formar una superfície transmembrana (Figura 3, B i E a G). La interfície està composta principalment per residus de Phe, Leu i Val a la regió transmembrana. Aquests residus estan apilats amb aminoàcids hidrofòbics i pigments αβ-14. Alguns residus polars també contribueixen a la interacció, inclòs l'enllaç d'hidrogen entre W-Thr68 i β-Trp42 a la superfície de la cavitat complexa (Figura 3, F i G). A la superfície del citoplasma, Gln34 és adjacent al grup ceto dels carotenoides αβ-14. A més, la molècula de n-dodecil β-d-maltòsid (β-DDM) es va resoldre i la seva cua hidrofòbica es va estendre fins a la interfície entre la proteïna W i αβ-14, i la cua lipídica pot estar localitzada al cos. També vam observar que les regions de resolució C-terminal de la proteïna W i RCH són molt properes, però no dins de l'abast de formar interaccions específiques (Figura 1, A i E). Tanmateix, hi pot haver interaccions en els aminoàcids C-terminals no resolts d'aquestes dues proteïnes, cosa que podria proporcionar un mecanisme per al reclutament de la proteïna W durant l'assemblatge del complex RC-LH114-W.
(A) La proteïna W, que mira cap a la interfície amb LH1αβ14 en forma de dibuix animat, té una cadena lateral en forma de vareta (vermella), que es mostra en una part del diagrama de potencial electrostàtic (superfície grisa transparent amb un nivell de contorn de 0,13). (B) La proteïna W representada per una superfície de color hidrofòbic. Les àrees polars i carregades es mostren en cian, les àrees hidrofòbiques es mostren en blanc i les àrees fortament hidrofòbiques es mostren en taronja. (C i D) La proteïna W representada en dibuix animat, la seva orientació és la mateixa que a (A) (C) i girada 180° (D). Segons la posició a la seqüència, els residus distingibles adopten un esquema de colors arc de Sant Martí, on l'extrem N-terminal és blau i l'extrem C-terminal és vermell. (E) La proteïna W en la mateixa vista que a (A), i els residus a la interfície de la proteïna W:LH1 es representen mitjançant varetes amb marques adjuntes. (F) La proteïna W està girada 90° respecte a (E) i LH1αβ14 a la representació de dibuixos animats, i respecte als residus de la interfície a la representació de barres. Els residus sobresortints del polipèptid beta estan etiquetats. El cofactor es mostra com una barra que coincideix amb el color de la Figura 1, el β-DDM descompost es mostra en gris i l'oxigen es mostra en vermell. (G) La vista a (F) està girada 180°, amb els residus prominents del polipèptid alfa marcat.
La proteïna W substitueix un heterodímer αβ (el 15è a la Figura 1F), evitant així el tancament del bucle i inclinant els tres primers heterodímers αβ. Es va observar que l'angle d'inclinació màxim del primer heterodímer αβ-1 respecte a la normal de la pel·lícula era de 25° a 29° (Figura 1, A i E), que es va formar per la inclinació de 2° a 8° d'αβ-1 en RC A sharp contrast-LH116 (Figura 1, B i F). El segon i el tercer heterodímers estan inclinats de 12° a 22° i de 5° a 10°, respectivament. A causa de l'impediment estèric de RC, la inclinació d'αβ-1 no inclou el segon parell d'αβ (que correspon al 16è αβ a la Figura 1F), formant així un buit clar a l'anell LH1 (Figura 1, A i E). A causa de la manca de dos heterodímers αβ, acompanyada de la pèrdua de quatre BChl i dos carotenoides, cap dels carotenoides s'uneix a la subunitat αβ-1 retorçada, donant lloc a un anell LH114-W que conté 13 carotenoides (vegetarians) i 28 BChls. Les estimacions de resolució local dels dos complexos a les regions αβ1 a 7 són inferiors a les de la resta del bucle LH1, cosa que pot reflectir la plasticitat inherent de la subunitat LH1 adjacent al lloc RC QB (Figura 4).
Les imatges de RC-LH114-W (A i B) i RC-LH116 (C i D) es mostren des de la mateixa vista superior/lateral (A i B) (A i C) i superfície de la cavitat de la figura 1 (B i D). Les tecles de colors es mostren a la dreta.
L'únic altre complex central característic amb una proporció estequiomètrica d'1:14 és el dímer RC-LH1-PufX de Rhodococcus sphaeroides (Rba.) (13). Tanmateix, la proteïna W i PufX no tenen cap homologia òbvia i tenen un impacte significatiu en les seves respectives estructures LH1. PufX és un únic TMH amb un domini citoplasmàtic N-terminal que interactua amb el costat citoplasmàtic de la subunitat RC-H (13) en una posició corresponent a Rps. palustris LH116αβ-16. PufX crea un canal per a l'intercanvi de quinona/quinolona entre RC-LH1 i el complex del citocrom bcl i és present en tots els complexos centrals de Rba. sphaeroides (13). Tot i que la interfície monòmer-monòmer és a Rba. El dímer sphaeroides RC-LH1-PufX es troba a la posició d'unió de la proteïna W a RC-LH114-W, i el buit induït per PufX i la proteïna W es troba en una posició equivalent (Figura S7A). El buit a RC-LH114-W també està alineat amb l'hipotètic canal de quinona (8) de Pseudomonas rosea LH1, que està format per pèptids no relacionats amb la proteïna W o PufX (Figura S7B). A més, el canal de quinona a Blc. L'LH1 verd maragda format per l'exclusió d'una subunitat γ (7) es troba en una posició similar (Figura S7C). Tot i que està mediat per diferents proteïnes, l'aparició d'aquests canals de quinona/quinolol en una posició comuna al complex RC-LH1 sembla ser un exemple d'evolució convergent, cosa que indica que el buit creat per la proteïna W pot actuar com un canal de quinona.
L'espai en el bucle LH114-W permet la formació d'una regió de membrana contínua entre l'espai intern del complex RC-LH114-W i la membrana a granel (Figura 1G), en lloc de connectar els dos dominis a través d'un porus proteic com en les proteïnes. El complex RC-LH116 és similar a un complex tancat en forma d'agulla de Tch. (22) (Figura 1H). Com que la difusió de la quinona a través de la membrana és més ràpida que la difusió a través del canal proteic estret, el bucle obert LH114-W pot permetre una renovació de RC més ràpida que el bucle tancat LH116, i la difusió de la quinona a la RC pot ser més restringida. Per tal de comprovar si la proteïna W afecta la conversió de quinones a través de RC, vam realitzar un assaig d'oxidació del citocrom en una certa concentració d'ubiquinona 2 (UQ2) (un anàleg de la UQ10 natural amb una cua d'isoprè més curta) (Figura 2E). Tot i que la presència de quinona quelada dificulta la determinació precisa de la constant aparent de Michaelis (RC-LH114-W i RC-LH116 són adequats per a 0,2 ± 0,1 μM i 0,5 ± 0,2 μM, respectivament), la taxa màxima de RC-LH114-W (4,6 ± 0,2 e-RC-1 s-1) és un 28 ± 5% més gran que la de RC-LH116 (3,6 ± 0,1 e-RC-1 s-1).
Inicialment vam estimar que la proteïna W és present en aproximadament el 10% del complex central (16); aquí, les taxes d'ocupació de les cèl·lules de creixement amb poca llum, llum mitjana i llum intensa són del 15 ± 0,6%, 11 ± 1% i 0,9 ± 0,5%, respectivament (Figura 2F). La comparació quantitativa de l'espectrometria de masses va mostrar que l'addició de l'etiqueta d'histidina no va reduir l'abundància relativa de la proteïna W en comparació amb les soques de tipus salvatge (P = 0,59), de manera que aquests nivells no són un artefacte de la proteïna W modificada (Figura S10). Tanmateix, aquesta baixa ocupació de la proteïna W al complex RC-LH1 pot permetre que algunes RC es capgirin a un ritme accelerat, mitigant així l'intercanvi més lent de quinona/quinolona al complex RC-LH116. Vam observar que l'alta taxa d'ocupació de la llum és inconsistent amb les dades transcriptòmiques recents, que indiquen que l'expressió del gen pufW augmenta sota llum forta (Figura S11) (23). La diferència entre la transcripció de pufW i la incorporació de proteïna W al complex RC-LH1 és confusa i pot reflectir la regulació complexa de la proteïna.
A RC-LH114-W, s'hi assignen i modelen 6 molècules de cardiolipina (CDL), 7 de fosfatidilcolina (POPC), 1 de fosfatidilglicerol (POPG) i 29 de β-DDM: 6 CDL, 24 POPC, 2 POPG i 12 βDDM. RC-LH116 (Figura 5, A i B). En aquestes dues estructures, la CDL es troba gairebé al costat citoplasmàtic del complex, mentre que la POPC, la POPG i la β-DDM es troben principalment al costat luminal. Es van aïllar dues molècules de lípid i detergent a la regió αβ-1 a αβ-6 del complex RC-LH114-W (Figura 5A), i cinc es van aïllar a la regió equivalent de RC-LH116 (Figura 5B). Es van trobar més lípids a l'altre costat del complex, principalment CDL, acumulades entre RC i αβ-7 a αβ-13 (Figura 5, A i B). Altres lípids i detergents estructuralment resolts es troben fora de l'anell LH1, i les cadenes acil ben resoltes s'estenen entre les subunitats LH1, designades provisionalment com a β-DDM a RC-LH114-W i definides com a β-DDM a RC Una barreja de β-DDM i POPC-LH116. Les posicions similars dels lípids i detergents quelants a la nostra estructura indiquen que són llocs d'unió fisiològicament rellevants (Figura S12A). Les posicions de les molècules equivalents a Tch també tenen una bona consistència. Gentle i Trv. Strain 970 RC-LH1s (Figura S12, B a E) (9, 12) i els residus d'enllaç d'hidrogen del grup del cap lipídic van mostrar una conservació força bona en l'alineació de seqüències (Figura S13), cosa que indica que la CDL conservada que s'uneix a RC (24), aquests llocs poden estar conservats al complex RC-LH1.
(A i B) Els pèptids RC-LH114-W (A) i RC-LH116 (B) es representen amb dibuixos animats, i els pigments amb bastonets, utilitzant l'esquema de colors de la Figura 1. Els lípids es mostren en vermell i els detergents en gris. La UQ unida als llocs RC QA i QB és groga, mentre que la UQ aïllada és blava. (C i D) Les mateixes vistes que (A) i (B), amb els lípids omesos. (E a ​​G) Vista ampliada de Q1(E), Q2(F) i Q3(G) de RC-LH116, amb cadenes laterals que s'influeixen mútuament. Els enllaços d'hidrogen es mostren com a línies negres discontínues.
A RC-LH116, tant RC QA com QB UQ, que participen en la transferència d'electrons en el procés de separació de càrrega, es descomponen als seus llocs d'unió. Tanmateix, a RC-LH114-W, la quinona QB no s'ha resolt i es discutirà en detall a continuació. A més de les quinones QA i QB, dues molècules UQ quelades (situades entre els anells RC i LH1) s'assignen a l'estructura RC-LH114-W segons els seus grups principals ben resolts (situats a Q1 i Q2, respectivament). Figura 5C). Dues unitats d'isoprè s'assignen a Q1, i el mapa de densitat resol les 10 cues d'isoprè completes de Q2. A l'estructura de RC-LH116, es van resoldre tres molècules UQ10 quelades (Q1 a Q3, Figura 5D), i totes les molècules tenen una densitat clara al llarg de la cua (Figura 5, D a G). En les dues estructures, les posicions dels grups de cap de quinona de Q1 i Q2 tenen una consistència excel·lent (Figura S12F), i només interactuen amb RC. Q1 es troba a l'entrada del gap W de RC-LH114-W (Figura 1G i 5, C, D i E), i Q2 es troba a prop del lloc d'unió QB (Figura 5, C, D) i F). Els residus conservats de L-Trp143 i L-Trp269 són molt propers a Q1 i Q2 i proporcionen possibles interaccions de π-stacking (Figura 5, E i F, i Figura S12). L-Gln88, a 3,0 Å de l'oxigen distal de Q1, proporciona un fort enllaç d'hidrogen (Figura 5E); aquest residu es conserva en tots els RC excepte en la relació més distant (Figura S13). L-Ser91 està substituït de manera conservadora per Thr a la majoria d'altres RC (Figura S13), es troba a 3,8 Å de l'oxigen metil de Q1 i pot proporcionar enllaços d'hidrogen febles (Figura 5E). Q3 no sembla tenir una interacció específica, però es troba a la regió hidrofòbica entre la subunitat RC-M i la subunitat LH1-α 5 a 6 (Figura 5, D i G). Q1, Q2 i Q3 o quinones quelades properes també s'han resolt a Tch. Gentle, Trv. Strain 970 i Blc. L'estructura de l'iris (9, 10, 12) apunta a un lloc d'unió de quinona auxiliar conservat al complex RC-LH1 (Figura S12G). Les cinc UQ descompostes a RC-LH116 concorden bé amb el 5,8 ± 0,7 de cada complex determinat per cromatografia líquida d'alta resolució (HPLC), mentre que les tres UQ descompostes a RC-LH114-W són inferiors a. El valor mesurat de 6,2 ± 0,3 (Fig. S14) indica que hi ha molècules d'UQ no resoltes a l'estructura.
Els polipèptids pseudosimètrics L i M contenen cadascun cinc TMH i formen un heterodímer que combina un dímer de BChl, dos monòmers de BChl, dos monòmers de bacteriòfag (BPh) i un ferro no hemo i una o dues molècules UQ10. A través de la presència d'enllaços d'hidrogen al grup cetona terminal i la seva acumulació coneguda en Rps, els carotenoides s'incorporen a la subunitat M, que s'anomena cis-3,4-deshidroorhodopina. Espècie (25). El domini de la membrana externa de RC-H està ancorat a la membrana per un únic TMH. L'estructura general de RC és similar a la de tres subunitats RC d'espècies relacionades (com ara Rba). sphaeroides (PDB ID: 3I4D). Els macrocicles de BChl i BPh, la cadena principal dels carotenoides i el ferro no hemo se superposen dins del rang de resolució d'aquestes estructures, igual que el grup principal UQ10 al lloc QA i la quinona QB a RC-LH116 (Figura S15).
La disponibilitat de dues estructures RC amb diferents taxes d'ocupació del lloc QB ofereix una nova oportunitat per examinar els canvis conformacionals consistents que acompanyen la unió de la quinona QB. En el complex RC-LH116, la quinona QB es troba a la posició "proximal" completament unida (26), però la separació de RC-LH114-W no té quinona QB. No hi ha quinona QB a RC-LH114-W, cosa que és sorprenent perquè el complex és actiu, més que el complex RC-LH116 amb quinona QB estructuralment resolta. Tot i que els dos anells LH1 quelen unes sis quinones, cinc estan estructuralment resoltes a l'anell RC-LH116 tancat, mentre que només tres estan estructuralment limitades a l'anell RC-LH114-W obert. Aquest augment del desordre estructural pot reflectir la substitució més ràpida dels llocs QB RC-LH114-W, una cinètica més ràpida de la quinona en el complex i una major probabilitat de creuar el bucle LH1. Suggerim que la manca d'UQ al lloc RC QB de RC-LH114-W pot ser el resultat d'un complex més complex i més actiu, i que el lloc QB de RC-LH114-W s'ha congelat immediatament en la renovació d'UQ. L'etapa específica (l'entrada al lloc QB s'ha tancat) reflecteix la conformació d'aquesta activitat.
Sense QB, la rotació que l'acompanya és de L-Phe217 a una posició incompatible amb la unió a UQ10, ja que causarà una col·lisió espacial amb la primera unitat d'isoprè de la cua (Figura 6A). A més, els principals canvis conformacionals evidents són evidents, especialment l'hèlix de (hèlix curta al bucle entre TMH D i E) on L-Phe217 es desplaça cap a la butxaca d'unió a QB i la rotació de L-Tyr223 (Figura 6A) per trencar l'enllaç d'hidrogen amb el marc M-Asp45 i tancar l'entrada del lloc d'unió a QB (Figura 6B). L'hèlix de pivota a la seva base, el Cα de L-Ser209 es desplaça 0,33 Å, mentre que el L-Val221Cα es desplaça 3,52 Å. No hi ha canvis observables a TMH D i E, que són superposables en ambdues estructures (Figura 6A). Pel que sabem, aquesta és la primera estructura de la RC natural que tanca el lloc QB. Una comparació amb l'estructura completa (unida a QB) mostra que abans que la quinona es redueixi, cal un canvi conformacional per fer-la entrar a la quinona. L-Phe217 gira per formar una interacció d'apilament π amb el grup principal de la quinona, i l'hèlix es desplaça cap a l'exterior, permetent que l'esquelet de L-Gly222 i la cadena lateral de L-Tyr223 formin una xarxa d'enllaços d'hidrogen amb una estructura d'enllaços d'hidrogen estable (Figura 6, A i C).
(A) Dibuix superposat de l'holograma (cadena L, cadena taronja/M, magenta) i l'estructura apo (gris), en què els residus clau es mostren en forma d'una representació en forma de vareta. UQ10 està representat per una barra groga. La línia puntejada indica els enllaços d'hidrogen formats a tota l'estructura. (B i C) La representació superficial de l'apolipoproteïna i tota l'estructura de l'anell, destacant l'oxigen de la cadena lateral de L-Phe217 en blau i L-Tyr223 en vermell, respectivament. La subunitat L és taronja; les subunitats M i H no estan acolorides. (D i E) Apolipoproteïna (D) i llocs RC QB sencers (E) [colorits per (A) respectivament] i PSII de Thermophilus thermophilus (verd, blau amb quinona de plàstic; ID PDB: 3WU2) Alineació (58).
Inesperadament, tot i que hi ha diverses estructures de RC deficients en QB sense LH1 disponibles, els canvis conformacionals observats en aquest estudi no s'havien descrit anteriorment. Aquests inclouen l'estructura de depleció de QB de Blc. viridis (PDB ID: 3PRC) (27), Tch. tepidum (PDB ID: 1EYS) (28) i Rba. sphaeroides (PDB ID: 1OGV) (29), totes elles gairebé iguals a la seva estructura QB general. Una inspecció detallada de 3PRC va revelar que les molècules de detergent LDAO (òxid de lauril dimetil amina) s'uneixen a l'entrada de la posició QB, cosa que pot impedir la reorganització en una conformació tancada. Tot i que LDAO no es descompon a la mateixa posició en 1EYS o 1OGV, aquestes RC es preparen utilitzant el mateix detergent i, per tant, poden produir el mateix efecte. L'estructura cristal·lina de Rba. Sphaeroides RC cocristal·litzat amb citocrom c2 (PDB ID: 1L9B) també sembla tenir un lloc QB tancat. Tanmateix, en aquest cas, la regió N-terminal del polipèptid RC-M (que interactua amb el lloc d'unió QB a través de l'enllaç H del residu Tyr a l'hèlix Q) adopta una conformació no natural, i el canvi conformacional QB no s'explora més (30). El que és tranquil·litzador és que no hem vist aquest tipus de deformació del polipèptid M en l'estructura RC-LH114-W, que és gairebé la mateixa que la regió N-terminal de RC RC-LH116. També cal tenir en compte que després de l'eradicació de l'antena LH1 basada en detergent, les RC d'apolipoproteïna del PDB es van resoldre, cosa que va eliminar els grups interns de quinona i els lípids a l'espai entre la RC i la superfície interna de l'anell LH1 circumdant (31, 32). L'RC continua sent funcional perquè conserva tots els cofactors, excepte la quinona QB descomponible, que és menys estable i sovint es perd durant el procés de preparació (33). A més, se sap que l'eliminació de LH1 i lípids cíclics naturals de l'RC pot tenir un impacte en les funcions, com ara la vida útil més curta de l'estat P+QB separat per càrregues (31, 34, 35). Per tant, especulem que l'existència de l'anell LH1 local que envolta l'RC pot mantenir el lloc QB "tancat", preservant així l'entorn local proper al QB.
Tot i que l'apolipoproteïna (sense quinona QB) i l'estructura completa representen només dues instantànies de la renovació del lloc QB, en lloc d'una sèrie d'esdeveniments, hi ha indicis que la unió es pot bloquejar per evitar la reunió per hidroquinona per inhibir la inhibició del substrat. La interacció del quinolol i la quinona prop del lloc QB de l'apolipoproteïna pot ser diferent, cosa que condueix al seu rebuig per part de la RC. Fa temps que s'ha proposat que els canvis conformacionals tenen un paper en la unió i la reducció de les quinones. La capacitat de les RC congelades per reduir les quinones després de l'adaptació a la foscor es veu afectada (36); la cristal·lografia de raigs X mostra que aquest dany es deu al fet que les quinones QB estan atrapades en una conformació "distal" a uns 4,5 Å de la posició proximal activa (26), 37). Suggerim que aquesta conformació d'unió distal és una instantània de l'estat intermedi entre l'apolipoproteïna i l'estructura de l'anell complet, que segueix la interacció inicial amb la quinona i l'obertura del lloc QB.
La RC de tipus II que es troba al complex PSII de certs bacteris i cianobacteris fotòtrofs, algues i plantes presenta conservació estructural i funcional (38). L'alineació estructural que es mostra a la Figura 6 (D i E) emfatitza la similitud entre les RC de PSII i el lloc QB del complex RC bacterià. Aquesta comparació ha estat durant molt de temps un model per estudiar els sistemes estretament relacionats d'unió i reducció de quinones. Publicacions anteriors van suggerir que els canvis conformacionals van acompanyats de la reducció de PSII de quinones (39, 40). Per tant, considerant la conservació evolutiva de la RC, aquest mecanisme d'unió no observat prèviament també pot ser aplicable al lloc QB de la RC de PSII en plantes fotòtrofes oxigenades.
Les soques Rps ΔpufW (deleció de pufW sense marcar) i PufW-His (proteïna W marcada amb His 10x al C-terminal expressada a partir del locus natural de pufW). palustris CGA009 es va descriure en el nostre treball anterior (16). Aquestes soques i el progenitor isogènic de tipus salvatge es van recuperar del congelador mitjançant el sembrat d'un petit nombre de cèl·lules en una placa PYE (cadascun 5 g litre -1) (emmagatzemada en LB a -80 °C, que contenia un 50% (p/v) de proteïna (glicerol), extracte de llevat i agar (succinat) [1,5% (p/v)]. La placa es va incubar durant la nit a les fosques a temperatura ambient en condicions anaeròbiques i després es va il·luminar amb llum blanca (~50 μmolm-2 s-1) proporcionada per bombetes halògenes OSRAM de 116 W (RS Components, Regne Unit) durant 3 a 5 dies fins que va aparèixer una sola colònia. Es va utilitzar una sola colònia per inocular 10 ml de medi M22+ (41) suplementat amb un 0,1% (p/v) de casaminoàcids (d'ara endavant, M22). El cultiu es va fer créixer en condicions de baix oxigen a la foscor a 34 °C amb agitació a 180 rpm durant 48 hores, i després es van inocular 70 ml del cultiu en les mateixes condicions durant 24 hores. Es va utilitzar un cultiu semiaeròbic amb un volum d'1 ml per inocular 30 ml de medi M22 en una ampolla de vidre transparent amb tap de rosca universal de 30 ml i es va irradiar amb agitació (~50 μmolm-2 s-1) durant 48 hores mitjançant una vareta d'agitació de força magnètica estèril. A continuació, es van inocular 30 ml del cultiu amb aproximadament 1 litre de cultiu en les mateixes condicions, que després es va utilitzar per inocular uns 9 litres de cultiu il·luminat a ~200 μmolm-2 s-1 durant 72 hores. Les cèl·lules es van recollir per centrifugació a 7132 RCF durant 30 minuts, es van resuspendre en ~10 ml de tris-HCl 20 mM (pH 8,0) i es van emmagatzemar a -20 °C fins que van ser necessàries.
Després de descongelar, afegiu uns cristalls de desoxiribonucleasa I (Merck, Regne Unit), lisozim (Merck, Regne Unit) i dos comprimits d'inhibidor de la proteasa holoenzim Roche (Merck, Regne Unit) a les cèl·lules resuspeses. En una cel·la de pressió francesa de 20.000 psi (Aminco, EUA), les cèl·lules es van interrompre de 8 a 12 vegades. Després d'eliminar les cèl·lules no trencades i les restes insolubles mitjançant centrifugació a 18.500 RCF durant 15 minuts a 4 °C, la membrana es va precipitar del lisat pigmentat mitjançant centrifugació a 113.000 RCF durant 2 hores a 43.000 °C. Descarteu la fracció soluble i resuspendre la membrana acolorida en 100 a 200 ml de tris-HCl 20 mM (pH 8,0) i homogeneïtzeu fins que no hi hagi agregats visibles. La membrana suspesa es va incubar en tris-HCl 20 mM (pH 8,0) (Anatrace, EUA) que contenia β-DDM al 2% (p/v) durant 1 hora a les fosques a 4 °C amb agitació suau. A continuació, es va centrifugar a 70 °C per dissoldre 150.000 RCF a 4 °C durant 1 hora per eliminar els insolubles residuals.
La membrana solubilitzant de la soca ΔpufW es va aplicar a una columna d'intercanvi iònic DEAE Sepharose de 50 ml amb tres volums de columna (CV) de tampó d'unió [20 mM de tris-HCl (pH 8,0) que contenia 0,03% (p/v) de β-DDM]. Rentar la columna amb dos tampons d'unió CV i després rentar la columna amb dos tampons d'unió que contenien 50 mM de NaCl. El complex RC-LH116 es va eluir amb un gradient lineal de 150 a 300 mM de NaCl (en tampó d'unió) a 1,75 CV, i el complex d'unió restant es va eluir amb un tampó d'unió que contenia 300 mM de NaCl a 0,5 CV. Recolliu l'espectre d'absorció entre 250 i 1000 nm, manteniu la fracció amb una relació d'absorbància (A880/A280) superior a 1 a 880 a 280 nm, diluïu-la dues vegades en el tampó d'unió i utilitzeu el mateix procediment de nou a la columna DEAE durant la purificació. Diluïu les fraccions amb relacions A880/A280 superiors a 1,7 i relacions A880/A805 superiors a 3,0, realitzeu la tercera ronda d'intercanvi iònic i conserveu les fraccions amb relacions A880/A280 superiors a 2,2 i relacions A880/A805 superiors a 5,0. El complex parcialment purificat es va concentrar a ~2 ml en un filtre centrífug Amicon de 100.000 pes molecular de tall (MWCO) (Merck, Regne Unit) i es va carregar en una columna d'exclusió de mida Superdex 200 16/600 (GE Healthcare, EUA) que contenia 200 mM de tampó de NaCl, i després es va eluir en el mateix tampó a 1,5 CV. Recollir els espectres d'absorció de la fracció d'exclusió de mida i concentrar els espectres d'absorció amb relacions A880/A280 superiors a 2,4 i relacions A880/A805 superiors a 5,8 a 100 A880, i utilitzar-los immediatament per a la preparació o emmagatzematge de la malla crio-TEM. Mantenir a -80 °C fins que es necessiti.
La membrana solubilitzant de la soca PufW-His es va aplicar a una columna de sefarosa HisPrep FF Ni-NTA de 20 ml (20 mM de tris-HCl (pH 8,0) que contenia 200 mM de NaCl i un 0,03% (p/p)) en tampó IMAC (GE Healthcare). v) β-DDM]. La columna es va rentar amb cinc CV de tampó IMAC i després amb cinc CV de tampó IMAC que contenia 10 mM d'histidina. El complex central es va eluir de la columna amb cinc tampons IMAC que contenien 100 mM d'histidina. La fracció que conté el complex RC-LH114-W es concentra a ~10 ml en un tanc amb agitació equipat amb un filtre Amicon 100.000 MWCO (Merck, Regne Unit), es dilueix 20 vegades amb tampó d'unió i després es suma a 25 ml. A la columna de sefarosa DEAE, s'utilitzen prèviament quatre CV units al tampó. Rentar la columna amb quatre tampons d'unió CV, després eluir el complex en vuit CV en un gradient lineal de 0 a 100 mM de NaCl (en tampó d'unió), i els quatre CV restants que contenien tampó d'unió de 100 mM. Els complexos residuals eluïts sobre el clorur de sodi combinat amb la relació A880/A280 superior a 2,4 i la relació A880/A805 superior a 4,6. Les fraccions es van concentrar a ~2 ml en un filtre centrífug Amicon 100.000 MWCO, i es van omplir amb IMAC d'1,5 CV en una columna d'exclusió de mida Superdex 200 16/600 equilibrada amb tampó previ, i després es van eluir en el mateix tampó a més d'1,5 CV. Recollir els espectres d'absorció de les fraccions d'exclusió de mida i concentrar els espectres d'absorció amb relacions A880/A280 superiors a 2,1 i relacions A880/A805 superiors a 4,6 a 100 A880, que s'utilitzen immediatament per a la preparació de la malla TEM congelada o s'emmagatzemen a -80 °C fins que es necessitin.
Es va utilitzar un congelador d'immersió Leica EM GP per preparar reixetes TEM de baixa temperatura. El complex es va diluir en tampó IMAC fins a A880 de 50, i després es van carregar 5 μl en una malla de coure recoberta de carboni QUANTIFOIL 1.2/1.3 recentment descarregada luminescentment (Agar Scientific, Regne Unit). Incubar la reixeta a 20 °C i 60% d'humitat relativa durant 30 s, després assecar-la durant 3 s i després apagar-la en età líquid a -176 °C.
Les dades del complex RC-LH114-W es van enregistrar a l'eBIC (Electronic Bioimaging Center) (British Diamond Light Source) amb un microscopi Titan Krios, que funciona a una tensió d'acceleració de 300 kV, amb un augment nominal de 130.000× i una energia de -. Trieu un interval de 20 eV. Es va utilitzar un Gatan 968 GIF Quantum amb detector de pics K2 per enregistrar imatges en mode de recompte per recollir dades. La mida del píxel calibrat és d'1,048 Å i la taxa de dosi és de 3,83 e-Å-2s-1. Es va recollir la pel·lícula en 11 segons i es va dividir en 40 parts. Es va utilitzar l'àrea recoberta de carboni per reenfocar el microscopi i, a continuació, es van recollir tres pel·lícules per forat. En total, es van recollir 3130 pel·lícules, amb valors de desenfoque entre -1 i -3 μm.
Les dades del complex RC-LH116 es van recollir utilitzant el mateix microscopi al Laboratori de Bioestructura Asterbury (Universitat de Leeds, Regne Unit). Les dades es van recollir en mode de recompte amb un augment de 130 k, i la mida del píxel es va calibrar a 1,065 Å amb una dosi de 4,6 e-Å-2s-1. La pel·lícula es va gravar en 12 segons i es va dividir en 48 parts. En total, es van recollir 3359 pel·lícules, amb valors de desenfoque entre -1 i -3 μm.
Tot el processament de dades es realitza al pipeline Relion 3.0 (42). Utilitzeu Motioncorr 2 (43) per corregir el moviment del feix mitjançant la ponderació de la dosi i, a continuació, utilitzeu CTFFIND 4.1 (44) per determinar el paràmetre CTF (funció de transferència de contrast). Les microfotografies típiques després d'aquestes etapes de processament inicials es mostren a la Figura 2. S16. La plantilla de selecció automàtica es genera seleccionant manualment uns 250 píxels de 1000 partícules en un marc de 250 píxels i sense classificació bidimensional (2D) de referència, rebutjant així les classificacions que compleixen amb la contaminació de la mostra o no tenen característiques discernibles. A continuació, es va realitzar la selecció automàtica a totes les microfotografies, i el RC-LH114-W tenia 849.359 partícules i el complex RC-LH116 tenia 476.547 partícules. Totes les partícules seleccionades s'han sotmès a dues rondes de classificació 2D sense referència i, després de cada execució, es rebutgen les partícules que coincideixen amb l'àrea de carboni, la contaminació de la mostra, sense característiques òbvies o partícules que se superposen fortament, donant lloc a 772.033 (90,9%) i 359.678 (75,5%) partícules. Les partícules s'utilitzen per a la classificació 3D de RC-LH114-W i RC-LH116 respectivament. El model de referència 3D inicial es va generar mitjançant el mètode de descens de gradient estocàstic. Utilitzant el model inicial com a referència, les partícules seleccionades es classifiquen en quatre categories en 3D. Utilitzant el model d'aquesta categoria com a referència, realitzeu un refinament 3D a les partícules de la categoria més gran, després utilitzeu el filtre de pas baix inicial de 15 Å per cobrir l'àrea del dissolvent, afegiu 6 píxels de vores suaus i postprocesseu els píxels per corregir la funció de transferència de modulació de pic de Gatan K2 del detector superior. Per al conjunt de dades RC-LH114-W, aquest model inicial es va modificar eliminant la forta densitat a les vores de la màscara (desconnectada de la densitat complexa del nucli a UCSF Chimera). Els models resultants (les resolucions de RC-LH114-W i RC-LH116 són 3,91 i 4,16 Å, respectivament) s'utilitzen com a referència per a la segona ronda de classificació 3D. Les partícules utilitzades s'agrupen a la classe 3D inicial i no contenen una forta correlació amb el veïnat. Superposició o manca de característiques estructurals òbvies. Després de la segona ronda de classificació 3D, es va seleccionar la categoria amb la resolució més alta [Per a RC-LH114-W, una categoria és de 377.703 partícules (44,5%), per a RC-LH116, hi ha dues categories, que sumen un total de 260.752 partícules (54,7%), on són iguals només quan s'alineen després de la rotació inicial amb una petita diferència]. Les partícules seleccionades es reextreuen en una caixa de 400 píxels i es refinen mitjançant refinament 3D. La màscara de dissolvent es genera utilitzant el filtre de pas baix inicial de 15 Å, l'expansió del mapa de 3 píxels i la màscara suau de 3 píxels. Utilitzant el refinament CTF per partícula, la correcció de moviment per partícula i la segona ronda de refinament CTF per partícula, el refinament 3D, l'emmascarament del dissolvent i el postprocessament es realitzen després de cada pas per refinar encara més la textura resultant. Utilitzant el valor de tall FSC (coeficient de correlació de capa de Fourier) de 0,143, les resolucions dels models finals de RC-LH114-W i RC-LH116 són de 2,65 i 2,80 Å, respectivament. La corba FSC del model final es mostra a la Figura 2. S17.
Totes les seqüències de proteïnes es descarreguen d'UniProtKB: LH1-β (PufB; UniProt ID: Q6N9L5); LH1-α (PufA; UniProt ID: Q6N9L4); RC-L (PufL; UniProt ID: O83005); RC-M (PufM; UniProt ID: A0A4Z7); RC-H (PuhA; UniProt ID: A0A4Z9); Protein-W (PufW; UniProt ID: Q6N1K3). SWISS-MODEL (45) es va utilitzar per construir un model d'homologia de RC, que conté les seqüències de proteïnes de RC-L, RC-M i RC-H i l'estructura cristal·lina de Rba. sphaeroides RC es va utilitzar com a plantilla (PDB ID: 5LSE) (46). Feu servir l'eina "ajustar mapa" a UCSF Chimera per ajustar el model generat al mapa (47), millorar l'estructura de la proteïna i afegir el cofactor [4×BChl a (nom del residu de la biblioteca de monòmers = BCL), 2×BPh a (BPH), un o dos tipus d'UQ10 (U10), un ferro no hemo (Fe) i una 3,4-dihidrohexacarbonilcolina (QAK)]. Utilitzeu Coot (48) per afegir. Com que QAK no està disponible a la biblioteca de monòmers, es va parametritzar mitjançant l'eina eLBOW a PHENIX (49).
A continuació, es va construir la subunitat LH1. Inicialment, es va utilitzar l'eina de construcció automàtica de PHENIX (49) per construir automàticament part de la seqüència LH1 utilitzant el mapa i les seqüències de proteïnes LH1-α i LH1-β com a entrada. Seleccioneu la subunitat LH1 més completa, extreieu-la i carregueu-la a Coot, afegiu-hi manualment la seqüència que hi falta i refineu manualment tota l'estructura abans d'afegir dos BCl a (BCL) i una espiriloxantina (CRT) [segons les Rps rellevants. La densitat del complex LH1 i el contingut de carotenoides conegut. Espècie (17)]. Copieu la subunitat LH1 completa i utilitzeu l'eina "Docking Map Tool" de la quimera UCSF per acoblar-la a l'àrea adjacent no model de densitat LH1 i, a continuació, refineu-la a Coot; repetiu el procés fins que s'hagin modelat totes les subunitats LH1. Per a l'estructura RC-LH114-W, extraient la densitat no assignada a Coot, la proteïna es segmenta dels components no proteics restants al mapa de quimeres de l'USCF i s'utilitza l'eina Autobuild per establir el model inicial i la modelització de les subunitats restants (proteïna-W). A PHENIX (49). Afegiu les seqüències que falten al model resultant a Coot (48) i, a continuació, refineu manualment tota la subunitat. La densitat no assignada restant s'ajusta a la combinació de lípids (ID de la biblioteca de monòmers PDB de CDL = CDL, POPC = 6PL i POPG = PGT), detergent β-DDM (LMT) i molècules UQ10 (U10). Utilitzeu l'optimització PHENIX (49) i l'optimització manual a Coot (48) per perfeccionar el model inicial complet fins que les estadístiques del model i la qualitat visual de l'ajust no es puguin millorar encara més. Finalment, utilitzeu LocScale (50) per afinar el mapa local i, a continuació, realitzeu diversos cicles més de modelització de la densitat no assignada i optimització automàtica i manual.
Els respectius pèptids, cofactors i altres lípids i quinones acoblats dins de les seves respectives densitats es mostren a les figures 1 i 2. S18 a S23. La informació estadística del model final es mostra a la taula S1.
A menys que s'especifiqui el contrari, els espectres d'absorció UV/Vis/NIR es van recollir en un espectrofotòmetre Cary60 (Agilent, EUA) a intervals d'1 nm de 250 nm a 1000 nm i un temps d'integració de 0,1 s.
Diluïu la mostra en una cubeta de quars amb un recorregut de 2 mm fins a A880 d'1 i recolliu l'espectre d'absorció entre 400 i 1000 nm. Els espectres dicroics circulars es van recollir en un espectropolímetre Jasco 810 (Jasco, Japó) a intervals d'1 nm entre 400 nm i 950 nm a una velocitat d'escaneig de 20 nm min-1.
El coeficient d'extinció molar es determina diluint el complex central fins a un A880 d'aproximadament 50. Diluïu el volum de 10 μl en 990 μl de tampó d'unió o metanol i recolliu l'espectre d'absorció immediatament per minimitzar la degradació de BChl. El contingut de BChl de cada mostra de metanol es va calcular mitjançant el coeficient d'extinció a 771 nm de 54,8 mM-1 cm-1, i es va determinar el coeficient d'extinció (51). Dividiu la concentració de BChl mesurada per 32 (RC-LH114-W) o 36 (RC-LH116) per determinar la concentració del complex central, que després s'utilitza per determinar l'espectre d'absorció de la mateixa mostra recollida en el tampó Coeficient d'extinció en paral·lel. Es van prendre tres mesures repetides per a cada mostra i es va utilitzar l'absorbància mitjana del màxim Qy de BChl per al càlcul. El coeficient d'extinció de RC-LH114-W mesurat a 878 nm és de 3280 ± 140 mM-1 cm-1, mentre que el coeficient d'extinció de RC-LH116 mesurat a 880 nm és de 3800 ± 30 mM-1 cm-1.
La UQ10 es va quantificar segons el mètode de (52). En resum, la HPLC de fase inversa (RP-HPLC) es va realitzar utilitzant el sistema Agilent 1200 HPLC. Dissoleu aproximadament 0,02 nmol de RC-LH116 o RC-LH114-W en 50 μl de metanol:cloroform 50:50 que conté un 0,02% (p/v) de clorur fèrric i injecteu la Beckman Coulter Ultrasphere ODS 4,6 mm preequilibrada. Dissoleu-la en 1 ml-1 min-1 a 40 °C en un dissolvent HPLC (80:20 metanol:2-propanol) en una columna de ×25 cm. Realitzeu una elució isocràtica en un dissolvent HPLC per controlar l'absorbància a 275 nm (UQ10), 450 nm (carotenoides) i 780 nm (BChl) durant 1 hora. Es va integrar el pic del cromatograma de 275 nm als 25,5 minuts, que no contenia cap altre compost detectable. L'àrea integrada s'utilitza per calcular la quantitat molar d'UQ10 extreta amb referència a la corba de calibratge calculada a partir de la injecció d'estàndards purs de 0 a 5,8 nmol (Figura S14). Cada mostra es va analitzar en tres rèpliques, i l'error reportat correspon a la desviació estàndard de la mitjana.
Es va preparar una solució que contenia el complex RC-LH1 amb una absorció màxima de Qy de 0,1 amb 30 μM de citocrom c2 reduït de cor de cavall (Merck, Regne Unit) i de 0 a 50 μMUQ2 (Merck, Regne Unit). Es van preparar tres mostres d'1 ml a cada concentració d'UQ2 i es van incubar durant la nit a les fosques a 4 °C per garantir una adaptació completa a la foscor abans de la mesura. La solució es va carregar en un espectrofotòmetre modular OLIS RSM1000 equipat amb una reixeta de flama de 300 nm/500 línies, una entrada d'1,24 mm, una ranura central de 0,12 mm i una sortida de 0,6 mm. Es col·loca un filtre de pas llarg de 600 nm a l'entrada del fototub de mostra i del tub fotomultiplicador de referència per excloure la llum d'excitació. L'absorbància es va controlar a 550 nm amb un temps d'integració de 0,15 s. La llum d'excitació s'emet des del LED (díode emissor de llum) M880F2 de 880 nm (Thorlabs Ltd., Regne Unit) a través d'un cable de fibra òptica a una intensitat del 90% a través d'un controlador DC2200 (Thorlabs Ltd., Regne Unit) i s'emet a la font de llum en un angle de 90°. El feix de mesura s'oposa al mirall per retornar qualsevol llum que no hagi estat absorbida inicialment per la mostra. Es controla l'absorbància 10 s abans de la il·luminància de 50 s. A continuació, es va controlar l'absorbància durant 60 s a la foscor per avaluar fins a quinolol redueix espontàniament el citocrom c23+ (vegeu la Figura S8 per a les dades en brut).
Les dades es van processar ajustant una taxa inicial lineal entre 0,5 i 10 s (segons la concentració d'UQ2) i fent la mitjana de les taxes de les tres mostres a cada concentració d'UQ2. La concentració de RC-LH1 calculada mitjançant el coeficient d'extinció respectiu es va utilitzar per convertir la taxa en l'eficiència catalítica, representada gràficament a Origin Pro 2019 (OriginLab, EUA), i ajustada al model de Michaelis-Menten per determinar els valors aparents de Km i Kcat.
Per a les mesures d'absorció transitòria, la mostra RC-LH1 es va diluir a ~2 μM en tampó IMAC que contenia 50 mM d'ascorbat de sodi (Merck, EUA) i 0,4 mM de terbutina (Merck, EUA). L'àcid ascòrbic s'utilitza com a donant d'electrons de sacrifici i el tert-butaclofen s'utilitza com a inhibidor de QB per garantir que el donant RC principal romangui reduït (és a dir, no fotooxidat) durant tot el procés de mesura. S'afegeixen aproximadament 3 ml de mostra a una cel·la rotativa personalitzada (d'uns 0,1 m de diàmetre, 350 RPM) amb una longitud de camí òptic de 2 mm per garantir que la mostra al camí làser tingui prou temps per a l'adaptació a la foscor entre els polsos d'excitació. Utilitzeu polsos làser d'aproximadament 100 fs per amplificar el sistema làser Ti: Sapphire (Spectra Physics, EUA) per excitar la mostra a 880 nm a una freqüència de repetició d'1 kHz (20 nJ per a NIR o 100 nJ per a Vis). Abans de recollir dades, exposeu la mostra a la llum d'excitació durant uns 30 minuts. L'exposició causarà la inactivació de l'activitat QA (possiblement reduint la QA una o dues vegades). Però tingueu en compte que aquest procés és reversible perquè després d'un llarg període d'adaptació a la foscor, la RC tornarà lentament a l'activitat QA. Es va utilitzar un espectròmetre Helios (Ultrafast Systems, EUA) per mesurar els espectres transitoris amb un temps de retard de -10 a 7000 ps. Utilitzeu el programari Surface Xplorer (Ultrafast Systems, EUA) per desagrupar els conjunts de dades, després fusioneu-los i estandarditzeu-los. Utilitzeu el paquet de programari CarpetView (Light Conversion Ltd., Lituània) per utilitzar el conjunt de dades combinat per obtenir espectres diferencials relacionats amb la decadència, o utilitzeu una funció que convolucioni múltiples exponents amb la resposta de l'instrument per ajustar l'evolució espectral d'una sola longitud d'ona a Origin (OriginLab, EUA).
Com s'ha esmentat anteriorment (53), es va preparar una pel·lícula fotosintètica que contenia el complex LH1 que no tenia ni l'antena RC ni l'antena perifèrica LH2. La membrana es va diluir en 20 mM de tris (pH 8,0) i després es va carregar en una cubeta de quars amb un camí òptic de 2 mm. Es va utilitzar un pols làser de 30 nJ per excitar la mostra a 540 nm amb un temps de retard de -10 a 7000 ps. Processeu el conjunt de dades tal com es descriu per a la mostra Rps.pal.
La membrana es va sedimentar per centrifugació a 150.000 RCF durant 2 hores a 4 °C i, a continuació, la seva absorbància a 880 nm es va resuspendre en 20 mM de tris-HCl (pH 8,0) i 200 mM de NaCl. Dissoleu la membrana remenant lentament en β-DDM al 2% (p/v) durant 1 hora a les fosques a 4 °C. La mostra es va diluir en carbonat de trietilamoni 100 mM (pH 8,0) (TEAB; Merck, Regne Unit) fins a una concentració de proteïna de 2,5 mg ml-1 (anàlisi Bio-Rad). El processament posterior es va dur a terme a partir del mètode publicat anteriorment (54), començant amb la dilució de 50 μg de proteïna en un total de 50 μl de TEAB que contenia laurat de sodi a l'1% (p/v) (Merck, Regne Unit). Després de la sonicació durant 60 s, es va reduir amb 5 mM de tris(2-carboxietil)fosfina (Merck, Regne Unit) a 37 °C durant 30 minuts. Per a la S-alquilació, incubeu la mostra amb 10 mM de metil S-metiltiometàsulfonat (Merck, Regne Unit) i afegiu-la des d'una solució mare d'isopropanol de 200 mM durant 10 minuts a temperatura ambient. La digestió proteolítica es va dur a terme afegint 2 μg de barreja de tripsina/endoproteinasa Lys-C (Promega Regne Unit) i es va incubar a 37 °C durant 3 hores. El tensioactiu laurat es va extreure afegint 50 μl d'acetat d'etil i 10 μl d'àcid trifluoroacètic (TFA; Thermo Fisher Scientific, Regne Unit) al 10% (v/v) de grau LC i agitant amb vòrtex durant 60 s. La separació de fases es va promoure mitjançant centrifugació a 15.700 RCF durant 5 minuts. Segons el protocol del fabricant, es va utilitzar una columna de centrifugació C18 (Thermo Fisher Scientific, Regne Unit) per aspirar i dessalar amb cura la fase inferior que contenia el pèptid. Després d'assecar-la mitjançant centrifugació al buit, la mostra es va dissoldre en TFA al 0,5% i acetonitril al 3%, i es van analitzar 500 ng mitjançant cromatografia RP de nanoflux acoblada amb espectrometria de masses utilitzant els paràmetres del sistema detallats anteriorment.
Utilitzeu MaxQuant v.1.5.3.30 (56) per a la identificació i quantificació de proteïnes per cercar la base de dades de proteomes de Rps. palustris (www.uniprot.org/proteomes/UP000001426). Les dades de proteòmica d'espectrometria de masses s'han dipositat a la ProteomeXchange Alliance a través del repositori de socis PRIDE (http://proteomecentral.proteomexchange.org) amb l'identificador de conjunt de dades PXD020402.
Per a l'anàlisi mitjançant RPLC acoblada amb espectrometria de masses d'ionització per electroaspersió, el complex RC-LH1 es va preparar a partir de Rps de tipus salvatge. Utilitzant el mètode publicat anteriorment (16), la concentració de proteïna produïda en cèl·lules de *palustris* va ser de 2 mg ml-1 en 20 mM Hepes (pH 7,8), 100 mM NaCl i 0,03% (p/v) β-(anàlisi Bio-Rad) DDM. Segons el protocol del fabricant, s'ha utilitzat un kit de purificació 2D (GE Healthcare, EUA) per extreure 10 μg de proteïna mitjançant el mètode de precipitació i dissoldre el precipitat en 20 μl d'àcid fòrmic (FA) al 60% (v/v), acetonitril al 20% (v/v) i aigua al 20% (v/v). Es van analitzar cinc microlitres mitjançant RPLC (Dionex RSLC) acoblada amb espectrometria de masses (Maxis UHR-TOF, Bruker). Utilitzeu una columna MabPac d'1,2 × 100 mm (Thermo Fisher Scientific, Regne Unit) per a la separació a 60 °C i 100 μlmin -1, amb un gradient del 85% (v/v) de dissolvent A [0,1% (v/v) de FA i 0,02% (V/v) de solució aquosa de TFA] al 85% (v/v) de dissolvent B [0,1% (v/v) de FA i 0,02% (v/v) en acetonitril TFA al 90% (v/v)]. Utilitzant una font d'ionització per electroaspersió estàndard i paràmetres per defecte durant més de 60 minuts, l'espectròmetre de masses obté de 100 a 2750 m/z (relació massa-càrrega). Amb l'ajuda de l'eina FindPept del portal de recursos bioinformàtics ExPASy (https://web.expasy.org/findpept/), mapeu l'espectre de masses a les subunitats del complex.
Les cèl·lules es van cultivar durant 72 hores sota 100 ml de llum NF baixa (10 μMm-2 s-1), mitjana (30 μMm-2 s-1) o alta (300 μMm-2 s-1). Medi M22 (medi M22 en què s'omet el sulfat d'amoni i es substitueix el succinat de sodi per acetat de sodi) en una ampolla amb tap de rosca de 100 ml (23). En cinc cicles de 30 segons, es van introduir perles de vidre de 0,1 micres en una proporció de volum d'1:1 per lisar les cèl·lules i es van refredar en gel durant 5 minuts. La matèria insoluble, les cèl·lules no trencades i les perles de vidre es van eliminar per centrifugació a 16.000 RCF durant 10 minuts en una microcentrífuga de taula. La membrana es va separar en un rotor de Ti 70.1 amb 100.000 RCF en tris-HCl 20 mM (pH 8.0) amb un gradient de sacarosa del 40/15% (p/p) durant 10 hores.
Com s'ha descrit en el nostre treball anterior, immunodetecció de l'etiqueta His en PufW (16). En resum, el complex central purificat (11,8 nM) o la membrana que conté la mateixa concentració de RC (determinada per oxidació restant l'espectre de diferència reduït i fent coincidir la càrrega del gel tenyit) en tampó de càrrega 2x SDS (Merck, Regne Unit) diluït dues vegades. Les proteïnes es van separar en un gel NuPage de bis-tris al 12% de rèplica (Thermo Fisher Scientific, Regne Unit). Es va tenyir un gel amb blau brillant de Coomassie (Bio-Rad, Regne Unit) per carregar i visualitzar la subunitat RC-L. La proteïna del segon gel es va transferir a una membrana de fluorur de polivinilidè (PVDF) activat amb metanol (Thermo Fisher Scientific, Regne Unit) per a l'immunoassaig. La membrana de PVDF es va bloquejar en 50 mM de tris-HCl (pH 7,6), 150 mM de NaCl, 0,2% (v/v) de Tween-20 i 5% (p/v) de llet desnatada en pols, i després es va incubar amb l'anticòs primari anti-His (en tampó d'anticossos diluït [50 mM de tris-HCl (pH 7,6), 150 mM de NaCl i 0,05% (v/v) de Tween-20] en 1:1000 A190-114A, Bethyl Laboratories, EUA) durant 4 hores. Després de rentar-la 3 vegades durant 5 minuts en tampó d'anticossos, la membrana es va combinar amb un anticòs secundari anti-ratolí de peroxidasa de rave picant (Sigma-Aldrich, Regne Unit) (diluït 1:10.000 en tampó d'anticossos). Incubar per permetre la detecció (5 minuts després de 3 rentats en tampó d'anticossos) utilitzant el substrat de quimioluminescència WESTAR ETA C 2.0 (Cyanagen, Itàlia) i l'Amersham Imager 600 (GE Healthcare, Regne Unit).
Dibuixant la distribució d'intensitat de cada gel tenyit o carril d'immunoassaig, integrant l'àrea sota el pic i calculant la relació d'intensitat de RC-L (gel tenyit) i Proteïna-W (immunoassaig), a ImageJ (57) processeu la imatge. Aquestes relacions es van convertir a relacions molars assumint que la relació de RC-L a proteïna-W en la mostra pura de RC-LH114-W era d'1:1 i normalitzant tot el conjunt de dades en conseqüència.
Per a materials suplementaris per a aquest article, consulteu http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/3/eabe2631/DC1
Aquest és un article d'accés obert distribuït sota els termes de la Llicència d'Atribució Creative Commons. L'article permet l'ús, la distribució i la reproducció sense restriccions en qualsevol mitjà, sempre que l'obra original es citi correctament.
Nota: Només us demanem que proporcioneu la vostra adreça electrònica perquè la persona que recomaneu a la pàgina sàpiga que voleu que vegi el correu electrònic i que no és correu brossa. No capturarem cap adreça electrònica.
Aquesta pregunta s'utilitza per comprovar si sou un visitant i evitar l'enviament automàtic de correu brossa.
David J. K. Swainsbury, Park Qian, Philip J. Jackson, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Elizabeth C. Martin, David A. Farmer, Lorna A. Malone, Rebecca F. Thompson, Neil A. Ranson, Daniel P. Canniffe, Mark J. Dickman, Dewey Holten, Christine Kirmaier, Andrew Hitchcock, C. Neil Hunter
L'estructura d'alta resolució del complex trampa de llum 1 al centre de reacció proporciona nous coneixements sobre la dinàmica de la quinona.
David J. K. Swainsbury, Park Qian, Philip J. Jackson, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Elizabeth C. Martin, David A. Farmer, Lorna A. Malone, Rebecca F. Thompson, Neil A. Ranson, Daniel P. Canniffe, Mark J. Dickman, Dewey Holten, Christine Kirmaier, Andrew Hitchcock, C. Neil Hunter
L'estructura d'alta resolució del complex trampa de llum 1 al centre de reacció proporciona nous coneixements sobre la dinàmica de la quinona.
©2021 Associació Americana per a l'Avenç de la Ciència. tots els drets reservats. AAAS és soci de HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef i COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.